魏春，任鄭，吳濤，錢曉芬，孫杰，汪釗

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin, Blf)是一種非血紅素鐵結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量為77 kDa，是由689個氨基酸組成的單一多肽鏈，具有廣譜的抗菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[1-9]，在食品添加劑、飼料添加劑、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。我國已將其列入GB14880—2012，認定其為食品營養(yǎng)強化劑。牛乳鐵蛋白抗菌機制主要是牛乳鐵蛋白水解產(chǎn)生的2個小肽的作用[10-11]。這2個小肽位于N末端上的17～30位和265～284位2個氨基酸結(jié)構(gòu)域[12-14]，而且這2個小肽在空間結(jié)構(gòu)上很相近，2個結(jié)構(gòu)域相互協(xié)作起作用，這比單一結(jié)構(gòu)域具有更強的抗菌活性[15]。牛乳鐵蛋白目前主要從牛乳中提取，生產(chǎn)成本高。微生物發(fā)酵法是一種降低牛乳鐵蛋白生產(chǎn)成本的極具潛力的方法。目前，牛乳鐵蛋白已經(jīng)在大腸桿菌中得到表達[16]，但容易形成包涵體，無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。畢赤酵母表達系統(tǒng)生長快，易于高密度發(fā)酵培養(yǎng)，且具有真核細胞翻譯后折疊修飾、加工、糖基化等功能[17-20]。畢赤酵母中醇氧化酶1(alcohol oxidase 1，AOX1)啟動子是一個強啟動子，已經(jīng)成功誘導(dǎo)表達了數(shù)百種外源蛋白[21-24]，因而畢赤酵母是表達牛乳鐵蛋白的優(yōu)良載體。

為便于分泌表達，本研究以較小分子質(zhì)量的牛乳鐵蛋白N端功能片段(包括2個功能結(jié)構(gòu)域的1～333氨基酸序列，bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf)為重組表達目標，目標基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后構(gòu)建重組質(zhì)粒，使用畢赤酵母GS115分泌表達。并比較了BSM、D’Anjou、RDM[25-26]三種高密度發(fā)酵培養(yǎng)基對目的蛋白表達的影響，為畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)牛乳鐵蛋白相關(guān)產(chǎn)品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

PichiapastorisGS115菌株為本實驗室保存。質(zhì)粒pPIC9K-BlfFf由擎科公司合成構(gòu)建。

1.1.2 引物

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.3 主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、DNA marker,TaKaRa公司；遺傳霉素(G418)、質(zhì)粒抽提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、TMB顯色液,上海生工；分子量蛋白marker、BSA、PVDF膜,索萊寶公司；Anti-6﹡His單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG二抗,浩克生物公司；Anti-6﹡His-tag親和層析柱(His-Trap HP),GE公司;His Tag ELISA Detection Kit試劑盒,南京金斯瑞。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY與BMMY配方參照Invitrogen公司的《畢赤酵母表達操作手冊》。

BSM培養(yǎng)基參照PichiaFermentation Guidelines (Version B，053002，Invitrogen)。

D’Anjou(g/L)培養(yǎng)基：(NH4)2SO420，KH2PO412，MgSO44.7，CaCl2·2H2O 0.36，甘油40，PTM1 4.35 ml/L，用5 mol/L的KOH調(diào)pH值到5.0。

RDM培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO41.65，KH2PO412，MgSO44.7，CaCl2·2H2O 0.36，甘油40，KOH 3.37，谷氨酰胺 1.74，精氨酸 1.46，PTM1 4.35 mL/L，用5 mol/L的KOH調(diào)pH值到5.0。

PTM1(g/L)：CuSO4·5H2O 6，NaI 0.08，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02， CoCl20.5，F(xiàn)eSO4·7 H2O 65，生物素 0.2，濃H2SO45 mL。

1.2 方法

1.2.1 重組酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的構(gòu)建與篩選

提取pPIC9K-BlfFf重組質(zhì)粒DNA，用Bpu1102 Ⅰ線性化處理，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115，加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L三梨醇，30 ℃孵育2 h，涂布于MD平板中，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h，在平板上加入適量無菌水并用玻璃棒涂布刮菌，菌液用無菌水稀釋至10-5，取50 μL分別涂布于含有0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板篩選抗性轉(zhuǎn)化子。挑選抗性轉(zhuǎn)化子接入YPD培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，用酵母基因組提取試劑盒提取基因組DNA，以alfa-sig-F、3‘AOX1-R鑒定BlfFf基因是否整合入酵母基因組中。設(shè)置空載體酵母重組子GS115-pPIC9K為陰性對照。

1.2.2 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達

將抗性平板上較大的單菌落接種于BMGY中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h(OD600≈2～6)，離心收集菌體，用適量的BMMY培養(yǎng)基懸浮菌體，接種于BMMY使其初始OD600=1.0，于30 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h添加100%甲醇，誘導(dǎo)濃度為0.5%。誘導(dǎo)結(jié)束離心取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?，實驗設(shè)GS115-pPIC9K為陰性對照。

1.2.3 表達產(chǎn)物的鑒定

取1 mL誘導(dǎo)96 h的發(fā)酵上清，以甲醇-氯仿法沉淀蛋白，用40 μL去離子水溶解蛋白，加入SDS-Loading Buffer后煮沸10 min，進行SDS-PAGE和Western Blot分析。轉(zhuǎn)印后的膜用0.5%的BSA封閉1 h，加入Anti-6﹡His單克隆抗體孵育1 h，PBST漂洗3次，10 min/次，再以HRP標記的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，PBST漂洗3次后，用TMB顯色。

1.2.4 重組牛乳鐵蛋白功能片段的純化

將離心后的發(fā)酵液上清過0.45 μm膜，再以超濾法除鹽濃縮，分別收集截留液和透過液。以截留上清過鎳柱，帶有His標簽的蛋白可與鎳柱中鎳結(jié)合，然后分別以40、100、150、250、500 mmol/L咪唑洗脫，收集洗脫峰與流穿液。以10 000 Da超濾管超濾，置換緩沖液，進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

1.2.5 重組牛乳鐵蛋白功能片段的質(zhì)譜鑒定

純化后的目的蛋白經(jīng)Western Blot鑒定后，將對應(yīng)的SDS-PAGE上目的條帶切膠后進行LC-MS鑒定(蘇州普泰生物醫(yī)藥有限公司檢測)。

1.2.6 重組酵母表達上清目的蛋白的ELISA定量檢測

按照南京金斯瑞公司His Tag ELISA Detection Kit試劑盒說明書操作。

1.2.7 三種高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)比較

挑選搖瓶表達量最大的菌株用于高密度發(fā)酵，以10%接種量分別接入含3 L BSM、RDM、D’Anjou培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐，用氨水、KOH、H3PO4調(diào)pH值至5.0，溫度為30 ℃，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣量，控制溶氧在20%以上。當(dāng)培養(yǎng)基中甘油消耗完后，溶氧(dissolved oxygen, DO)快速上升(DO>60%)，隨即開始流加含有PTM1的質(zhì)量濃度為500 g/L的甘油200 mL，流速50 mL/h。流加結(jié)束后饑餓30 min，流加含有PTM1的100%甲醇進行誘導(dǎo)，控制比生長速率在0.015 h-1左右，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣量，控制溶氧大于20%，誘導(dǎo)后每12 h分別取樣，測定目的蛋白含量與菌體濕重。

2 結(jié)果與討論

2.1 GS115-pPIC9K-BlfFf重組菌的構(gòu)建與篩選

M-DNA marker 2k plus；2-對照(GS115-pPIC9K)；1、3～12-重組轉(zhuǎn)化子中BlfFf的PCR產(chǎn)物圖1 重組酵母菌的PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant yeast by PCR

將合成的重組質(zhì)粒pPIC9K-BlfFf電轉(zhuǎn)化入P.pastorisGS115，通過組氨酸營養(yǎng)型與G418抗性篩選，得到重組酵母GS115-pPIC9K-BlfFf。GS115-pPIC9K-BlfFf中BlfFf的PCR結(jié)果顯示(圖1)含有1 200 bp的目的基因擴增條帶，對照GS115-pPIC9K無擴增條帶，測序結(jié)果與目的基因序列相同。結(jié)果表明表達牛乳鐵蛋白功能片段的重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-BlfFf構(gòu)建成功。

2.2 表達產(chǎn)物的鑒定

2.2.1 SDS-PAGE分析

挑選表達量較高的克隆進行發(fā)酵。發(fā)酵上清的SDS-PAGE分析顯示，與GS115-pPIC9K菌株相比，重組酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的發(fā)酵上清可見分子質(zhì)量約為37 kDa的蛋白條帶(圖2)。

M-蛋白分子量marker；1～8-高抗性轉(zhuǎn)化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1～8的發(fā)酵上清；9-GS115-pPIC9K的發(fā)酵上清圖2 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE profile of expression products

2.2.2 搖瓶發(fā)酵上清的Western Blot分析

Western Blot檢測結(jié)果顯示，重組酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的搖瓶發(fā)酵上清與Anti-6﹡His單克隆抗體可發(fā)生特異性反應(yīng)，在37 kDa處有特異性條帶可見，與SDS-PAGE結(jié)果一致，見圖3。

M-蛋白分子量marker；1～8-高抗性轉(zhuǎn)化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1～8的發(fā)酵上清；9-GS115-pPIC9K的發(fā)酵上清圖3 搖瓶發(fā)酵上清的Western Blot分析Fig.3 Western Blot analysis for the fermentation supernatant in shake flask

結(jié)果表明，構(gòu)建的GS115-pPIC9K-BlfFf, 75%轉(zhuǎn)化子成功分泌表達牛乳鐵蛋白功能片段，4#、5#轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清未發(fā)生特異性反應(yīng)，為假陽性。蛋白灰度掃描結(jié)果表明3#菌表達能力最強(圖3)，選取該菌株用于高密度發(fā)酵試驗。

2.3 重組牛乳鐵蛋白功能片段的純化與質(zhì)譜鑒定

以鎳鰲合親和層析柱對表達的牛乳鐵蛋白功能片段進行純化，在40、100、150 mmol/L咪唑濃度下分別得到洗脫峰(圖4)。經(jīng)SDS-PAGE檢測，150 mmol/L咪唑下的洗脫峰樣品在37 kDa處出現(xiàn)單一條帶(圖5)。100 mmol/L咪唑下無蛋白，可能是核酸等雜質(zhì)污染導(dǎo)致起峰。Western Blot鑒定結(jié)果顯示，150 mmol/L咪唑濃度下的洗脫峰樣品在37 kDa處顯色，出現(xiàn)特異性條帶，且顯色最深，為主要的蛋白洗脫峰；40 mmol/L咪唑濃度下的洗脫峰樣品也出現(xiàn)分子量符合的特異性條帶，說明目的蛋白組分與鎳柱結(jié)合能力存在差異；流穿液樣品中含有少量目的蛋白，說明有部分蛋白沒有結(jié)合(圖6)。實驗表明，親和層析可以較有效地純化牛乳鐵蛋白功能片段。

圖4 發(fā)酵上清鎳柱親和層析過程圖Fig.4 Time course of nickel affinity chromatographic purification with fermentation supernatant

M-蛋白分子量marker；1-菌株P(guān). pastoris GS115-pPIC9K甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵上清；2-菌株P(guān). pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵上清；3-40 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；4-100 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；5-150 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；6-鎳柱流穿液濃縮脫鹽上清圖5 純化樣品的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of purification samples

純化后的目的產(chǎn)物經(jīng)LC-MS鑒定，確定分子量和氨基酸序列與預(yù)計相符，表明該蛋白得到正確表達。

2.4 三種高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)比較

M-蛋白分子量marker；1-鎳柱流穿濃縮脫鹽上清；2-100 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；3-150 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；4-菌株P(guān). pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵上清；5-40 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；6-菌株P(guān). pastoris GS115-pPIC9K甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵上清圖6 純化產(chǎn)物的Western Blot分析Fig.6 Western Blot analysis for the purification products

BSM、RDM、D’Anjou三種培養(yǎng)基是畢赤酵母高密度發(fā)酵中使用較多的培養(yǎng)基配方。取GS115-pPIC9K-BlfFf-3菌株，分別使用BSM、RDM、D’Anjou 3種培養(yǎng)基進行高密度發(fā)酵以表達牛乳鐵蛋白功能片段。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)48 h(發(fā)酵72 h)后，菌體濕重在3種培養(yǎng)基中分別達到350、297、233 g/L(圖7-A)。

A-BSM、D’Anjou、RDM三種培養(yǎng)基的菌體生長曲線；B-BlfFf在BSM、D’Anjou、RDM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)表達時間過程； C-表達產(chǎn)物的Western Blot分析(M-Marker; 1-D’Anjou發(fā)酵樣品; 2-RDM發(fā)酵樣品; 3-BSM發(fā)酵樣品)圖7 BlfFf在3種不同高密度培養(yǎng)基中的生產(chǎn)比較Fig.7 Comparison of BlfFf production in high-cell-density fermentation with three different media

在甲醇誘導(dǎo)階段，菌體生長速度較慢， BSM、RDM、D’Anjou培養(yǎng)基中酵母平均比生長速率分別為0.016 h-1、0.012 h-1、0.008 h-1。隨著誘導(dǎo)時間的增加，目的蛋白的產(chǎn)量逐漸增加。在甲醇誘導(dǎo)24 h后，目的蛋白表達量增長明顯。誘導(dǎo)48 h后，RDM、BSM培養(yǎng)基中產(chǎn)量相差不大，分別為38.1、29.5 mg/L，D’Anjou培養(yǎng)基中表達量為20.3 mg/L(圖7-B)。綜合比較，選擇RDM作為高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。由于RDM鹽濃度較低，使用該培養(yǎng)基既可以減少培養(yǎng)基成本，又可以減少分離純化過程中的脫鹽步驟且使后期處理更加便利。誘導(dǎo)結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)Western Blot分析，確認目的蛋白得到表達(圖7-C)。

3 結(jié)論

以牛乳鐵蛋白N端功能片段(1～333氨基酸序列)為重組表達目標，經(jīng)密碼子優(yōu)化基因序列后，連接至表達載體pPIC9K，構(gòu)建重組表達載體pPIC9K-BlfFf并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115篩選得到3#高表達菌株；表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化，在150 mmol/L咪唑濃度下洗脫得到37 kDa目標條帶，Western Blot和質(zhì)譜鑒定表明純化得到了正確表達的牛乳鐵蛋白功能片段。3#菌株分別用3種培養(yǎng)基進行高密度發(fā)酵，結(jié)果表明RDM培養(yǎng)基最優(yōu)，甲醇誘導(dǎo)48 h，目的蛋白表達量為38.1 mg/L。與傳統(tǒng)的BSM培養(yǎng)基比較，采用RDM培養(yǎng)基降低了培養(yǎng)基成本及分離純化過程中的脫鹽成本，為該產(chǎn)品工業(yè)放大生產(chǎn)提供了依據(jù)。