薛曉陽 （華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北 邯鄲 056000）

賀凱麗 張向文 王娟娟 趙姍姍 孔肖肖 秦曉麗 王雨蒙

（河北省蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 河北 邯鄲）

河北一蛋雞場REV抗體檢測異常，選擇30只蛋雞，進(jìn)行血清REV抗體檢測，全血REV病原檢測，同時(shí)固定雞只所產(chǎn)種蛋入孵，出雛雛雞進(jìn)行肝臟和全血REV病原檢測，檢測結(jié)果種雞血清抗體滴度平均值在10000左右，病原檢測陰性，出雛雛雞全血及肝臟REV病原檢測均為陰性。得出結(jié)論該REV抗體滴度陽性雞群子代0日齡檢測為陰性，無垂傳現(xiàn)象。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(REV)引起的鴨、火雞、雞和野禽的一組癥狀不同的綜合征。包括免疫抑制、致死性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤、生長抑制綜合征(矮小綜合征)以及淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤[1]。目前養(yǎng)殖企業(yè)會(huì)定期進(jìn)行REV抗體檢測，以評(píng)估雞群感染壓力。在集約化養(yǎng)殖場實(shí)行管理上的防疫措施只能在一定程度上減少禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的感染機(jī)會(huì)，但并不能保證雞群呈陰性狀態(tài)，同時(shí)查閱國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示全國有一定的流行。張丹俊等對安徽省不同地區(qū)9個(gè)雞場、7個(gè)不同地方品種雞471份血清樣本中有250份為陽性，全省7個(gè)不同地方品種雞總體個(gè)體陽性感染率高達(dá)53.1%；被檢的9個(gè)雞場中均有陽性感染雞群，被檢雞場陽性感染率為100%；不同雞場的不同批次差異較大[2]。崔治中等[3]對來自全國從南到北5省市9個(gè)公司100個(gè)雞群的約2400份血清樣品的ELISA檢測表明，有60%以上的雞群在不同時(shí)期感染過REV，不同地區(qū)不同雞群的REV抗體陽性率從0到100%不等，平均約為20%，綜上表明雞群REV感染較為普遍。針對REV病源檢測核酸探針方法是一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測技術(shù)，操作簡單，結(jié)果易于判定，是目前常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，也是本次試驗(yàn)的主要應(yīng)用方法[4]。主要針對篩選出的REV抗體陽性雞只進(jìn)行種蛋入孵，以評(píng)價(jià)是否垂傳，以此進(jìn)行調(diào)查，為種蛋的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 陽性雞只 從種雞場選擇REV抗體陽性雞只30只，品種為海蘭褐蛋雞，日齡153d該場區(qū)多次檢測陽性率為100%，但雞群生產(chǎn)指標(biāo)正產(chǎn)，雞群解剖無REV癥狀存在。

1.2 試劑 RNA 提取試劑盒，OMEGA品牌，批號(hào)R6874-02，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Takara 品牌，批號(hào)A112361A，2*PCR mix天根品牌，批號(hào)R7129。REV抗體檢測試劑和，IDEXX產(chǎn)品，批號(hào)：FP466斑點(diǎn)雜交試劑，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)腫瘤研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 設(shè)備 溫箱，樹立儀器、烘箱，樹立儀器、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、PCR儀，伯樂T100，孵化器。

1.4 引物 REV-FGGACTCAATTCCCGTAT-CA GA， REV-R TCTTCCCAGCGACCTTTAC，片段大小為775bp，擴(kuò)增條件為REV：體系為25μl，上下引物各μl，mix 12.5μl，模板2μl，雙蒸水9.5μ，反應(yīng)條件為95℃，5min；31個(gè)循環(huán)(95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min20s)72℃，10min[4]。

1.5 斑點(diǎn)雜交方法 參照山東農(nóng)業(yè)大學(xué)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室方法[5]。

1.6 試驗(yàn)方法 （1）蛋雞檢測：采集30只種雞血清進(jìn)行REV抗體檢測。采集全血進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測。（2）種蛋檢測：單籠固定雞只，收集受精種蛋30枚進(jìn)行入孵，21d出殼后取肝臟和全血檢測REV病毒方法為PCR+斑點(diǎn)雜交。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 種雞血清檢測結(jié)果 見表1。

表1 試驗(yàn)用雞REV抗體檢測結(jié)果

2.2 種雞REV核酸檢斑點(diǎn)雜交檢測結(jié)果 見表2。

表2 試驗(yàn)用種雞REV核酸病原檢測結(jié)果

2.3 孵化結(jié)果 孵化種蛋30枚，出雛28只，雞只聲音宏亮，體重在初產(chǎn)蛋體重范圍之內(nèi)。

3 結(jié)果

（1）種雞REV抗體檢測，從檢測結(jié)果得出抗體幾何平均值為10378，最大值為19317，最小值為4132，因國內(nèi)目前無REV疫苗免疫，確定雞群受到REV感染，并且抗體滴度值較高，表明接觸REV病原時(shí)間較長。（2）同時(shí)對種雞進(jìn)行REV核酸檢測，方法PCR+斑點(diǎn)雜交，從檢測結(jié)果得出在REV高抗體存在的情況下，機(jī)體進(jìn)行REV檢測，病原檢測呈陰性。（3）對出雛雛雞全血和肝臟進(jìn)行病源檢測，結(jié)果均為陰性，同時(shí)出雛數(shù)據(jù)均正常，孵化率為93.3%，出雛重量及均勻度良好。

4 討論

（1）雞群REV高抗體存在，且陽性率100%是該場區(qū)的一個(gè)特點(diǎn)，針對該種雞場情況進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，從檢測結(jié)果可以看出在抗體滴度達(dá)到10000左右的時(shí)候，垂傳為零。但造成該狀況的原因尚無定論，雞痘病毒(FPV)野毒和疫苗毒整合禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(REV)全基因或基因片段的現(xiàn)象普遍存在，由此引起的生物風(fēng)險(xiǎn)分析已成為許多研究學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，并且有臨床報(bào)到禽痘疫苗污染引起的病例[6-7]。但疫苗污染后群體抗體水平會(huì)達(dá)到多少陽性率無相關(guān)報(bào)到。（2）種雞群抗體滴度在10000左右從孵化及種雞生產(chǎn)分析來看對生產(chǎn)影響不大，但需要后續(xù)跟蹤子代生產(chǎn)成績，更加深入的進(jìn)行評(píng)判。同時(shí)要對場區(qū)高陽性率來源進(jìn)行原因查找。（3）研究表明多數(shù)雛雞容易在早期感染REV，且易產(chǎn)生耐受性病毒血癥，維持長期的病毒血癥卻不產(chǎn)生抗體，同時(shí)成為雞群內(nèi)REV的傳染源[8]，因此，下次試驗(yàn)會(huì)結(jié)合雛雞的REV抗體走勢及生產(chǎn)成績進(jìn)行綜合評(píng)判，結(jié)合此次結(jié)果初步判斷高抗體陽性雞只0日齡雛雞無REV檢出，為是否發(fā)生垂傳提供初步判斷。

5 結(jié)論

從種雞生產(chǎn)情況得出，種雞REV抗體10000的滴度水平，雞群病原檢測陰性，對應(yīng)種蛋入孵，雛雞產(chǎn)品檢測無REV病原檢測到，總體良好，至此得出REV高抗體雞群種蛋無垂傳現(xiàn)象。