李淑煥 薄永恒 （山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 濟(jì)南 250100 ②山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南）

本著綠色環(huán)保需求，按照中藥嚴(yán)密組方原則和中獸醫(yī)理、法、方、藥中獨(dú)特的“異病同治”的治療原則，制備了一種中藥復(fù)方制劑。本制劑是由板藍(lán)根、大青葉等多味中藥組成，主要治療禽的傳染性支氣管炎。由于病毒病與炎癥的密切聯(lián)系，前期已對(duì)本中藥復(fù)方進(jìn)行了靶動(dòng)物臨床實(shí)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)室抗炎藥理實(shí)驗(yàn)，治療效果顯著，為探究其抗炎機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)以小白鼠跖腫脹炎癥模型為主，測(cè)定了相關(guān)炎癥因子水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 中藥復(fù)方制劑(由板藍(lán)根、大青葉等多味中藥組成)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制；三氯乙酸、1%角叉菜膠，正丁醇、硫代巴比妥酸、氫氧化鉀、甲醇，均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 18～22g健康昆明鼠，購(gòu)于中牧集團(tuán)動(dòng)物房。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器 AL204精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、UV-120-02型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)、DNM-9602G型酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠足跖腫脹炎癥模型制作[1]取健康昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半，分開(kāi)飼養(yǎng)，分別為中藥復(fù)方制劑灌胃高劑量組(16g/kg)、中藥復(fù)方制劑灌胃低劑量組(8g/kg)、模型組。其中模型組每次注射與制劑等體積生理鹽水，連續(xù)4d。最后一次給藥0.5h后，每只小鼠右后足足壞皮下注射1%角叉菜膠0.03m1致炎，4h后拉頸處死小鼠，齊踝關(guān)節(jié)切下兩后足分別精確稱重。

1.2.2 小鼠炎性組織中中PGE2含量的測(cè)定[2]在上述角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)中處死小鼠，齊踝關(guān)節(jié)切下炎足，剝皮后浸于裝有2.5ml生理鹽水的試管中，充分振蕩，2h后取出炎足，將浸泡液在離心機(jī)上3000rpm離心15min；取上清液0.5mI，加入到2m1 0.5mol/L KOH-甲醇溶液中，在50℃水浴中異構(gòu)化20min；水浴后加甲醇至5m1進(jìn)行稀釋，在分光光度計(jì)278nm處測(cè)紫外吸收，以吸光度表示溶液中PGE2含量，OD278與質(zhì)量的換算公式如下：CPGE2(μg/g)=A×13.31×D×V/炎足重(V=PGE2溶液體積，D：稀釋倍數(shù))。

1.2.3 小鼠炎性組織中血清溶菌酶含量的測(cè)定在上述角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)中處死小鼠前眼眶取血，離心，取血清，-20℃保存待測(cè)，測(cè)定方法按南京建成試劑公司血清溶菌酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定方法測(cè)定。

1.2.4 小鼠炎性組織中丙二醛(MDA)[3]及血清中一氧化氮(NO)[4]含量的測(cè)定 在上述角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)中處死小鼠前眼眶取血，離心，取血清，用Griess試劑法測(cè)血清中一氧化氮的含量；將上述角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹試驗(yàn)中小鼠炎足剪碎放置于0.45ml20%的三氯醋酸(TCA)中浸泡，4h后棄炎足，加入0.1mo1/L鹽酸1ml，1%的硫代巴比妥酸(TBA)0.55ml，充分混勻，90～95℃水浴中保溫15min，然后加2ml生理鹽水稀釋，3000r/min離心5min，取上清液于532 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算MDA含量。

1.2.5 小鼠炎性組織中組胺(histamine)和5-色胺(5-TH)含量的測(cè)定[5]將上述角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹試驗(yàn)中小鼠炎足劃破皮膚組織后浸泡于酸化正丁醇4.0ml中4h，超聲處理20min，按熒光分光光度法測(cè)組胺、5-色胺的含量。

2 結(jié)果

2.1 小鼠炎性組織中PGE2含量

結(jié)果(表1)表明，中藥復(fù)方制劑高劑量組與模型組相比較差異不顯著(P＞0.05)，中藥復(fù)方制劑低劑量組與模型組相比較差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明中藥復(fù)方制劑對(duì)炎足中的PGE2的釋放沒(méi)有顯著的影響。

表1 中藥復(fù)方制劑對(duì)角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹炎性組織中PGE 含量

2.2 小鼠炎性組織中血清溶菌酶含量

結(jié)果(表2)表明，中藥復(fù)方制劑高劑量組與模型組組相比較差異顯著(P＞0.05)，中藥復(fù)方制劑低劑量與模型組組相比較差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明中藥復(fù)方制劑不能明顯抑制致炎后血清溶菌酶的釋放。

表2 中藥復(fù)方制劑對(duì)血清溶菌酶含量的影響

2.3 小鼠炎性組織中丙二醛(MDA)[3]及血清中一氧化氮(NO)[4]含量

結(jié)果(表3)表明，中藥復(fù)方制劑在8g/kg劑量下能顯著抑制炎性組織中MDA及血清NO的釋放，而高劑量對(duì)炎性組織中MDA及血清NO的釋放抑制不明顯。

表3 中藥復(fù)方制劑對(duì)炎性組織中MDA及血清NO含量的影響

2.4 對(duì)小鼠炎性組織中組胺(histamine)和5-色胺(5-TH)含量的測(cè)定[5]

結(jié)果(表4)表明，中藥復(fù)方制劑在高劑量(16g/kg)下能顯著抑制炎性組織中組胺的釋放，低劑量對(duì)炎性組織中組胺的釋放抑制不明顯；中藥復(fù)方制劑能顯著抑制炎性組織中5-色胺的釋放，且以高劑量為優(yōu)。

表4 中藥復(fù)方制劑對(duì)炎性組織中組胺和5羥色胺含量的影響

3 討論

（1）中藥復(fù)方制劑是一種抗病毒新獸藥，它在禽傳染性支氣管炎的預(yù)防與治療中有良好的效果。而炎性反應(yīng)是最基本的病理過(guò)程和機(jī)體對(duì)損傷性刺激最原始的保護(hù)性反應(yīng)，也是許多不同類型疾病的一個(gè)共同的病理基礎(chǔ)，包括生物性(感染、超敏反應(yīng)等)、化學(xué)性及物理性等病因性疾病[6]。（2）研究表明中藥復(fù)方制劑具有抗氧化能力，清除氧自由基，減少丙二醛的釋放，避免機(jī)體損傷；可以抑制細(xì)胞釋放的血管活性胺類炎性介質(zhì)—組胺、5-色胺的釋放，從而減少毛細(xì)血管通透性的增加；明顯抑制血清中一氧化氮的過(guò)量釋放，減少了它的細(xì)胞毒作用；而對(duì)溶菌酶的釋放以及腎上腺素E2的釋放無(wú)抑制作用。研究結(jié)果提示，中藥復(fù)方制劑抗炎機(jī)制與抑制炎性組織中丙二醛、組胺、5-色胺及血清中一氧化氮的釋放有關(guān)。