高飛雄，梁引庫，李云祥

陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

蒲公英(TaraxacummongolicumHand-Mazz)是一種藥食兩用的多年生草本植物，具有廣譜抗菌、保肝利膽、抗內(nèi)毒素、健胃和免疫促進(jìn)作用?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究確認(rèn)，蒲公英同屬植物中含有多種生物活性成分，主要包括黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、香豆素類、三萜類、植物甾醇類、胡蘿卜素類、色素類、揮發(fā)油等[1,2]。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英花中含有較豐富的酚酸類和黃酮類物質(zhì)[3,4]，而這些物質(zhì)在抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤等方面均具有較強(qiáng)的生物活性[5]。目前，中國食品添加劑種類繁多，但多數(shù)為化學(xué)添加劑，具有一定的安全隱患，而安全性高、無毒副作用且具有一定保健功能的植物天然食品添加劑較少。因此開發(fā)無毒、天然、安全且具有保健作用的食品添加劑是當(dāng)今食品添加劑發(fā)展的新趨勢[6,7]。植酸是從植物種子中提取的一種有機(jī)磷酸類化合物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日用化工等行業(yè)[8]，尤其是在食品行業(yè)中，植酸因其良好的抗氧化性能和高度絡(luò)合金屬離子的特性，常用于水產(chǎn)品、酒類、新鮮果蔬等的穩(wěn)定劑和保鮮劑[9,10]。

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見食品污染源，是引起食物中毒和食源性疾病爆發(fā)的主要病原菌之一。據(jù)統(tǒng)計，沙門氏菌引起的食物中毒常居世界首位[11]。研究表明，全世界每年因沙門氏菌感染而導(dǎo)致死亡的病例就達(dá)到了約300萬起[12]。因此開發(fā)對沙門氏菌具有一定抑制作用的天然食品添加劑就成為可能。

本研究從廣譜抗菌植物蒲公英中提取了蒲公英植酸，分析了蒲公英植酸對沙門氏菌的抑制作用，并分析了蒲公英植酸對沙門氏菌的生長動力學(xué)、細(xì)胞通透性和細(xì)胞膜的影響，以期為沙門氏菌的防治提供理論基礎(chǔ)以及為天然食品添加劑的研發(fā)提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗材料與試劑

蒲公英，購于漢中藥材市場，經(jīng)陜西理工大學(xué)李新生教授鑒定為菊科蒲公英(Taraxacummongolicum)。植酸標(biāo)品(純度≥94%，購于上海源葉生物有限公司)。沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，ATCC14028)由中國藥品生物制品檢定所中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心提供，-20 ℃低溫冰箱凍存。實驗前復(fù)蘇傳代使用。

蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂(購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；碘化丙啶(PI)(購自sigma公司)；氯化鈉(購自天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司)

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；搖擺式粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；JD-150E型超聲波清洗機(jī)(寧波金達(dá)超聲波儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；THZ-82氣浴恒溫振蕩器(常州市國立實驗設(shè)備研究所) FA2204B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；TGL-20臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；UV2550型分光光度計(日本島津公司)；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SJ-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；VEGA3-XMU掃描電鏡(沈陽華儀時代科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡XSP-63XDV(上海光學(xué)儀器一廠)。

2 實驗方法

2.1 蒲公英植酸的提取與純化

取粉碎后過篩蒲公英30 g，加12倍量的水，調(diào)pH為2，于25 ℃下攪拌7～8 h。過濾取濾液，用石灰水調(diào)節(jié)pH為4，然后加入10% NaOH，使最終pH值為6.5。靜置1 h后抽濾，棄濾液，用蒸餾水洗滌沉淀2～3次，得粗品蒲公英植酸鈣。向提取的植酸鈣中加少量水和稀鹽酸，攪拌30 min，過濾后取濾液。將上述所得的可溶性植酸鹽上陽離子交換柱，流速12 mL/min，收集過柱液即為蒲公英植酸，70～80 ℃條件下濃縮蒲公英植酸至瓶內(nèi)溶液呈稀稠狀，然后冷凍干燥48 h，即為植酸干粉[13]。

2.2 高效液相測定蒲公英植酸

分別配制2 mg/mL的植酸標(biāo)品溶液和樣品溶液，過0.22 μm超濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜條件如下：色譜柱為DiKMA Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，等度洗脫，流動相5 mmol/L NaAc，流速0.5 mL/min，UV254 nm[14]。

2.3 蒲公英植酸對沙門氏菌的抑制作用

利用濾紙片法[15,16]分析蒲公英植酸對沙門氏菌的抑制作用。配制2 mg/mL的植酸樣品溶液，將高壓蒸汽滅菌的無菌濾紙片浸入其中，備用。將凍存的沙門氏菌菌種于室溫時轉(zhuǎn)涂LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜活化，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。挑活化后單菌落于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、170 rpm搖床中培養(yǎng)5 h至OD600 nm為0.6，取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上。然后用鑷子將分別蘸有植酸和無菌水的無菌濾紙片貼于培養(yǎng)基平板表面，作為實驗組和對照組。在37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑大小，以抑菌圈直徑為指標(biāo)評價提取液的抑菌效果。

2.4 蒲公英植酸最小抑菌濃度測定

實驗采用倍比稀釋法[17]。按照2.3的方法，將活化后的單菌落在搖床中培養(yǎng)12 h，用液體LB培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)到107CFU/mL。分別向裝有2 mL LB培養(yǎng)基的10 mL試管中加入蒲公英植酸樣品，讓植酸樣品與一定量的LB液體培養(yǎng)基在試管中進(jìn)行倍比稀釋，最終使菌液中植酸濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，以0 mg/mL作為對照，分別于37 ℃、170 rpm 培養(yǎng)24 h，測OD600 nm值，與對照比較，OD600 nm下降一半及以上的第一個稀釋濃度為蒲公英植酸的最低抑菌濃度，設(shè)為MIC[18]。

2.5 蒲公英植酸對細(xì)胞通透性影響

按照2.4的方法培養(yǎng)沙門氏菌，將濃度為107CFU/mL的沙門氏菌菌液于6 000 rpm離心10 min，收集菌體，PBS(pH5.8)洗三次。用含0.01% Tween80的PBS懸浮菌體，使其濃度為109CFU/mL。分別向裝有2 mL懸浮菌體的10 mL試管中加入蒲公英植酸提取物，使溶液中蒲公英植酸提取物最終濃度為0×MIC、0.5×MIC、1×MIC、2×MIC。以0×MIC作為空白對照，再設(shè)不加菌液對照組，其中無菌液但含有2×MIC濃度的植酸，37 ℃、180 rpm培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6 h取樣200 μL，8 000 rpm離心5 min后測上清液OD260nm值。

2.6 植酸對沙門氏菌生長曲線的影響

按照2.4的方法培養(yǎng)沙門氏菌。分別向裝有4 mL LB液體培養(yǎng)基的10 mL試管中加入蒲公英植酸，使培養(yǎng)基中植酸最終濃度為0、1、3×MIC，以0×MIC作為對照，按體積分?jǐn)?shù)4%(V/V)接入備用菌液，分別于37 ℃、200 rpm培養(yǎng)，每隔3 h取樣200 μL，測其OD600 nm值。根據(jù)測量結(jié)果，繪制生長動力學(xué)曲線。

2.7 掃描電鏡(SEM)分析蒲公英植酸對沙門氏菌的抑制作用

按照2.4的方法培養(yǎng)沙門氏菌。分別取2 mL懸浮菌體，加入蒲公英植酸，使溶液中蒲公英植酸最終濃度為0、0.5、1、2×MIC，以0×MIC作為對照，37 ℃、200 rpm培養(yǎng)5 h，取1 mL的菌體樣品，8 000 rpm離心5 min，用PBS(pH5.8)洗滌2次，然后加入2.5%戊二醛(以25%戊二醛、去離子水和PBS為1∶4∶5的比例配制成體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液)固定4 h，使用呈梯度濃度的乙醇脫水(50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇，重懸浸泡10 min，8 000 rpm離心5 min)，用真空冷凍干燥機(jī)干燥12 h。鍍金后上SEM觀察[19-21]。

2.8 熒光染色觀察

按照2.3的方法培養(yǎng)活化后的沙門氏菌3 h至其OD600 nm為0.4。分別將直徑15 mm無菌蓋玻片放入多孔細(xì)胞培養(yǎng)皿4孔中，每孔加0.5 mL懸浮菌體和1.5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下過夜培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，分別加入蒲公英活性成分植酸，使溶液中蒲公英植酸最終濃度為0、0.25、0.5、1×MIC，以0×MIC作為對照。培養(yǎng)至5 h時，用PBS洗玻片2次。然后在黑暗條件下，用PI染色5分鐘，PBS洗玻片2次去除殘留染液，使用熒光顯微鏡觀察。

2.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0、Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析、圖表的制作等，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)評估，使用單因素方差分析比較差異組，*P<0.05和**P<0.01分別代表差異性顯著和極顯著，抑菌機(jī)理實驗重復(fù)三次，實驗結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 植酸的提純與鑒定

高效液相色譜分析植酸標(biāo)準(zhǔn)品和蒲公英植酸樣品，如圖1表明，蒲公英植酸樣品液相色譜圖(圖1A)在4.8 min有一色譜峰，與植酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖(圖1B)相同，這表明提取的蒲公英樣品為蒲公英植酸，通過面積法計算蒲公英提取液中蒲公英植酸的純度為86.51%。

圖1 液相色譜分析蒲公英植酸Fig.1 Analysis of dandelion phytic acid by liquid chromatography注： A為植酸標(biāo)品液相色譜圖，B為植酸樣品液相色譜圖。Note:A is the liquid chromatogram of phytic acid standard,B is the liquid chromatogram of phytic acid sample.

圖2 植酸對沙門氏菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of phytic acid on Salmonella注：A和B為無菌水對照，C和D為植酸實驗組。Note:A and B are sterile water controls, and C and D are phytic acid experimental groups.

3.2 蒲公英植酸對沙門氏菌的抑制作用

由圖2可知，對照組無菌水紙片周圍沒有抑菌圈，表明水對細(xì)菌的生長沒有影響。實驗組蒲公英植酸紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈，其抑菌圈直徑可達(dá)13.38 mm，表明蒲公英植酸對沙門氏菌是具有一定的抑菌效果。

3.3 最小抑菌濃度測定

濃度梯度分析沙門氏菌的最小抑菌濃度，由表1可知，隨著蒲公英植酸濃度的增加，蒲公英植酸對沙門氏菌的生長抑制能力逐漸加大，當(dāng)植酸的濃度為0.2 mg/mL時，沙門氏菌OD600nm下降≥50%，可見，蒲公英植酸對沙門氏菌的最小抑菌濃度為0.2 mg/mL。

表1 蒲公英植酸對沙門氏菌的最小抑菌濃度測定(mg/mL)Table 1 Determination of the minimum inhibitory concentration of dandelion phytic acid on Salmonella

注：“-”指與生長對照比較OD600 nm下降<50%，“+”指與生長對照比較OD600 nm下降≥50%。

Note:"-" refers to a decrease of OD600 nmof <50% compared to the growth control,"+" means a decrease of OD600 nmby ≥50% compared to the growth control.

3.4 植酸對沙門氏菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的重要組成部分，具有重要的屏障作用，但當(dāng)菌體處于不利生長條件或者受到抑菌劑作用時，其細(xì)胞膜就會遭到破壞，使細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)(如DNA、RNA等)通過細(xì)胞膜外泄到菌懸液中，而核酸物質(zhì)在260 nm處有吸收峰，導(dǎo)致菌懸液在260 nm處的吸光度增大。因此，可以通過測定菌懸液在260 nm處的吸光度值來判斷菌體細(xì)胞膜的完整性[22]。由圖3可知，空白對照組的菌懸液在培養(yǎng)6 h時間內(nèi)，其在260 nm波長的紫外吸收光度值變化較小。不加菌液對照組基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，可排除植酸對吸光度的影響。實驗組菌懸液在同一時間內(nèi)與對照組相比在260 nm波長的紫外吸收變化較大，差異達(dá)到顯著水平，而且這一變化隨著時間的推移而增大。這表明植酸使沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)容物濃度增加。因此可推測蒲公英植酸是破壞沙門氏菌細(xì)胞膜，使沙門氏菌內(nèi)部的核酸等大分子物質(zhì)外泄，進(jìn)而導(dǎo)致沙門氏菌死亡而達(dá)到抑制沙門氏菌生長的作用。

3.5 植酸對沙門氏菌生長曲線的影響

蒲公英植酸對沙門氏菌生長影響(圖4)表明，對照組沙門氏菌生長符合細(xì)菌的典型生長規(guī)律，即S型生長。在菌液中加入蒲公英植酸后，細(xì)菌的生長曲線呈現(xiàn)出明顯的差別。在1倍和3倍MIC濃度植酸作用下，2 h后菌液在600 nm處的OD值顯著低于對照組。這表明蒲公英植酸對沙門氏菌有抑制作用，并且濃度不同，抑制效果也不同，較高濃度的植酸是可以極大地抑制沙門氏菌的生長，因此其生長曲線始終處于較低的平穩(wěn)狀態(tài)。而低濃度的植酸雖然也能夠有效抑制細(xì)菌活性，但效果不如較高濃度，從而導(dǎo)致其菌液OD值有所上升。

圖3 植酸對沙門氏菌細(xì)胞膜通透性影響Fig.3 Effect of phytic acid on cell permeability of Salmonella注：不加菌液對照組：無菌液，含有濃度為2×MIC的植酸。Note:No bacterial control group:sterile solution containing phytic acid at a concentration of 2 MIC.

圖4 不同濃度植酸作用下沙門氏菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of Salmonella with different concentrations of phytic acid

3.6 掃描電鏡(SEM)

不同濃度植酸對沙門氏菌進(jìn)行處理，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組沙門氏菌其結(jié)構(gòu)比較完整，形態(tài)飽滿，呈現(xiàn)典型的短桿狀(圖5A)。而植酸處理后的沙門氏菌菌體欠飽滿(圖5B)，部分細(xì)胞表面褶皺，形態(tài)扭曲變形(圖5C)，并且在細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞(圖5D)。由此可見，植酸對沙門氏菌的細(xì)胞膜具有損壞作用，同時，高濃度的植酸比低濃度的植酸對細(xì)胞更具有破壞力，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，造成細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，這與沙門氏菌膜通透性分析一致。

3.7 熒光染色觀察

PI是一種細(xì)胞核染料，可以對壞死細(xì)胞的DNA和RNA進(jìn)行染色并呈現(xiàn)紅色熒光[23]，當(dāng)細(xì)胞受損后細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA外泄可導(dǎo)致紅色熒光出現(xiàn)。利用此原理，通過PI對沙門氏菌進(jìn)行單染后顯微鏡觀察(圖 6)。結(jié)果表明，對照組無紅色熒光(圖 6A)，表明沙門氏菌菌液在沒有加入植酸時，無細(xì)胞壞死。圖 6B、C和D中有紅色熒光出現(xiàn)，并且隨著植酸濃度的增加，紅色熒光出現(xiàn)的范圍也在增大，這表明植酸可以通過改變沙門氏菌膜通透性促使細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)外流，從而被PI熒光染料染成紅色，且植酸濃度越大，對細(xì)胞膜通透性影響越大。

圖5 菌株掃描電鏡圖(10 000×)Fig.5 Scanning electron microscope image of strains(10 000×)注：A為空白對照組；B、C、D實驗組植酸濃度依次是0.5MIC、1MIC、2MIC。Note:A is a blank control group;the phytic acid concentrations of the B,C,and D experimental groups are 0.5 MIC,1 MIC,and 2 MIC.

圖6 PI染色熒光圖(40×)Fig.6 PI staining fluorescence map(40×)注：圖A為空白對照組；圖B、C、D實驗組植酸濃度依次為0.25MIC、0.5MIC、1MIC。Note:Fig.A is the blank control group;the phytic acid concentrations in the experimental groups B,C,and D are 0.25 MIC,0.5 MIC,and 1 MIC.

4 結(jié)論

本研究表明，蒲公英植酸對沙門氏菌具有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，通過多組實驗表明，蒲公英植酸濃度在2 mg/mL時對沙門氏菌的抑菌圈直徑為13.38 mm。通過對其抑菌機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，植酸通過破壞沙門氏菌細(xì)胞膜通透性從而達(dá)到抑菌甚至是滅菌的效果，并且濃度越高，其抑菌效果越好。最小抑菌濃度分析表明，植酸對沙門氏菌的最小抑菌濃度為0.2 mg/mL。通透性影響和生長動力學(xué)實驗證明植酸對沙門氏菌的抑制是通過破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞滲透性增加，導(dǎo)致菌體細(xì)胞質(zhì)外滲，進(jìn)而使細(xì)胞凋亡，而且植酸濃度越高，細(xì)胞膜破壞就越嚴(yán)重，菌體細(xì)胞質(zhì)外滲也就越明顯。掃描電鏡和熒光染色進(jìn)一步證明了植酸可以使細(xì)菌表面褶皺，甚至破裂，進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡以及內(nèi)容物的外泄，并且這種現(xiàn)象隨著植酸含量的增加變得越來越嚴(yán)重。本研究揭示了蒲公英植酸對沙門氏菌的抑菌性能及抑菌機(jī)理，以期為沙門氏菌的防治提供理論基礎(chǔ)以及為基于天然食品添加劑的研發(fā)提供參考。