高力揚(yáng)，張 凱，王巧輝，裴佳瑞，馬澤華，李 敏*

1寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2寧夏大學(xué)新華學(xué)院，銀川750021

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)是引起綿羊、山羊傳染性胸膜肺炎及增生性間質(zhì)性肺炎的病原體，對(duì)寧夏灘羊養(yǎng)殖業(yè)危害較大。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、泰樂菌素、紅霉素及阿奇霉素等對(duì)綿羊支原體肺炎具有減緩病情的作用，但無法根治該病，而且易產(chǎn)生耐藥性。以往研究發(fā)現(xiàn)支原體對(duì)機(jī)體有免疫抑制作用，主要體現(xiàn)在：促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡[1,2]，影響炎癥因子表達(dá)[3,4]，抑制巨噬細(xì)胞自噬[5]。甘草酸提取于甘草根部，是甘草中最主要的活性成分，可溶于水，分子式為C42H62O16，可以水解為2分子葡萄糖醛酸和1分子甘草次酸。目前研究顯示甘草提取物有抑菌能力[6,7]，增強(qiáng)雞巨噬細(xì)胞吞噬和清除胞內(nèi)沙門氏菌的能力[8]，對(duì)治療病毒性肝炎[9]、抑制銅綠假單胞菌[10]、雞混合艾美耳球蟲感染的免疫調(diào)節(jié)有一定作用[11]，而且可以抑制豬嗜血支原體對(duì)紅細(xì)胞的黏附[12]。然而甘草酸對(duì)天然免疫細(xì)胞的影響尚不明確，因此本研究聚焦甘草酸在巨噬細(xì)胞抗MO感染中發(fā)揮的作用，為利用增強(qiáng)天然免疫的方式來預(yù)防綿羊支原體肺炎提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

胎牛血清購自全式金公司，高糖DMEM、胰酶、PBS購自Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗、馬血清購自Solarbio公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自碧云天公司；mRNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；凋亡及自噬相關(guān)基因引物由Sangon Biotech公司合成；Real-time PCR相關(guān)試劑盒購自TaKaRa公司；Bad抗體、Bax抗體、腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒、Western Blot顯色劑、DMSO、NanoDrop 8000設(shè)備、QuantStudio 5設(shè)備購自Thermo Fisher公司；GAPDH購自北京義翹神州科技有限公司；支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)、支原體肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；甘草酸使用PBS配制為12、1.2、120、12 μM濃度。全波段酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；多模式微孔板檢測(cè)儀購自PerkinElmer公司；流式細(xì)胞儀購自德國Sysmex公司。

1.2 甘草酸的配制

稱取甘草酸粉末溶于溫PBS中，渦旋震蕩溶解后用0.22 μm的過濾器過濾，配制成終濃度為120 mM的甘草酸儲(chǔ)存液，4 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)一共分為對(duì)照組、甘草酸處理組、MO感染組、甘草酸/MO感染組。其中對(duì)照組及MO感染組分別加入與甘草酸處理組、甘草酸/MO感染組稀釋前甘草酸儲(chǔ)存液相同體積的PBS緩沖液作為參照。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2天進(jìn)行傳代處理，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)

接種2 000～5 000個(gè)細(xì)胞懸浮于100 μL培養(yǎng)基中，接種于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)試劑，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h后用全波段酶標(biāo)儀450 nm波長處測(cè)定吸光值。

1.6 Western blot

將各個(gè)分組中細(xì)胞裂解后采用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，配平后加入蛋白上樣緩沖液金屬浴100 ℃保持5 min。Bad、Bax、GAPDH一抗1∶1 000稀釋，4 ℃下孵育12 h，二抗1∶10 000稀釋后室溫下孵育2 h后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Real-time PCR

將各個(gè)分組中細(xì)胞裂解后采用mRNA提取試劑盒對(duì)細(xì)胞mRNA進(jìn)行提取， NanoDrop 8 000進(jìn)行濃度測(cè)定后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，按照TaKaRa Real-time PCR試劑盒說明利用QuantStudio 5設(shè)備對(duì)凋亡及自噬相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。

1.8 ELISA

取各個(gè)分組細(xì)胞培養(yǎng)上清用于ELISA檢測(cè)，TNF-α檢測(cè)步驟參照試劑盒內(nèi)說明書，酶標(biāo)儀讀取450 nm處OD值。

1.9 細(xì)胞周期檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為2組，分別為對(duì)照組和甘草酸處理組，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞于1 mL預(yù)冷的70%乙醇中-20 ℃固定一夜。采用細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理兩組細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

表1 Real-time qPCR引物序列Table 1 The Real-time qPCR primer sequences

1.10 MO培養(yǎng)

支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)33 g溶解于1 L蒸餾水中，高壓后冷卻至室溫，加入20%馬血清、80萬單位氨芐青霉素、1%醋酸鉈10 mL，充分混勻后分裝于50 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱保存。Y98標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌赛S色(pH6.8)左右時(shí)1∶5傳代培養(yǎng)。MO濃度采用顏色變化單位測(cè)定法(colour change unit,CCU)計(jì)算，即十倍梯度稀釋MO菌液后觀察MO培養(yǎng)基顏色變化，以最后發(fā)生顏色改變的稀釋倍數(shù)為待檢的MO菌液的CCU。

1.11 甘草酸處理RAW264.7

將預(yù)先配置好的甘草酸儲(chǔ)存液用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到合適濃度，然后用稀釋好的甘草酸對(duì)待處理細(xì)胞進(jìn)行換液處理，空白對(duì)照組將所用甘草酸儲(chǔ)存液相應(yīng)體積的PBS用新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行同比稀釋處理并對(duì)待處理細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.12 MO侵染RAW264.7

RAW264.7細(xì)胞對(duì)數(shù)生長時(shí)，以5×106的密度接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁且生長狀態(tài)良好，12 000 rpm，10 min離心收集MO并用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液將MO重懸后按感染復(fù)數(shù)MOI=10∶1加入待感染的細(xì)胞，并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別提取各個(gè)分組細(xì)胞的總蛋白及總mRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用GraphPad Prism 7.04，兩組數(shù)據(jù)之間采用T tests非參數(shù)檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)，三組及三組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 甘草酸對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的毒性檢測(cè)

為了驗(yàn)證不同濃度甘草酸對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響，我們采用12、1.2、120、12 μM濃度的甘草酸-PBS溶液處理RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性(圖1)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比濃度為120、12 μM的甘草酸顯著提高RAW 264.7巨噬細(xì)胞活性(P<0.000 1，P=0.012 9)；而12、1.2 mM高濃度甘草酸與對(duì)照組相比顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞存活(P<0.000 1)。因此本實(shí)驗(yàn)采用最小濃度12 μM甘草酸溶液處理細(xì)胞。

圖1 篩選適合RAW264.7巨噬細(xì)胞的甘草酸處理濃度Fig.1 Optimal concentation for glycyrrhizic acid to treat RAW264.7 macrophages.注：(120 μmol/L)*** P <0.000 1 vs對(duì)照組；(12 μmol/L) * P=0.012 9 vs對(duì)照組；(12 mmol/L、1.2 mmol/L) *** P <0.000 1 vs對(duì)照組。Note：(120 μmol/L)*** P <0.000 1 vs Control；(12 μmol/L) * P=0.012 9 vs Control；(12 mmol/L、1.2 mmol/L) *** P <0.000 1 vs Control.

2.2 甘草酸對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

圖2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)甘草酸處理前后RAW264.7巨噬細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：與未處理組相比甘草酸處理后，處于G1期的細(xì)胞數(shù)量減少，S期細(xì)胞數(shù)量減少，G2期細(xì)胞數(shù)量增加。

2.3 甘草酸對(duì)受MO感染的RAW 264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

取CCU濃度為1×107生長良好的MO，按照 MOI值為10∶1感染RAW264.7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為無感染對(duì)照組，MO感染組，經(jīng)甘草酸處理的MO感染組，分別培養(yǎng)24 h后檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比24 h內(nèi)MO沒有顯著抑制RAW264.7的生長(P=0.659 4)，加入甘草酸組中RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖顯著增加(P=0.021 7，圖3)。

圖2 甘草酸處理前后巨噬細(xì)胞周期。Fig.2 Cell cycle in non-treated and glycyrrhizic acid treated macrophages注：左側(cè)為未處理組，右側(cè)為甘草酸處理組。Note：The left side is the untreated group,and the right side is the glycyrrhizic acid treated group.

圖3 甘草酸對(duì)受MO感染的RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響。Fig.3 Effect of glycyrrhizic acid on cell viability of MO-infected RAW264.7 macrophages注：P=0.659 4 MO感染組 vs對(duì)照組； *P=0.021 7 甘草酸+MO組vs對(duì)照組。Note：P=0.659 4 MO treated vs Control; *P=0.021 7 glycyrrhizic acid+MO treated vs Control.

2.4 甘草酸調(diào)控MO感染后巨噬細(xì)胞中TNF-α的分泌

為了驗(yàn)證甘草酸對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA分析巨噬細(xì)胞上清液中的TNF-α的表達(dá)量(圖4)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比MO感染后巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)量顯著下降(P<0.000 1)，而正常巨噬細(xì)胞在甘草酸處理后TNF-α的表達(dá)量也會(huì)顯著降低(P=0.009 7)，但加入甘草酸的巨噬細(xì)胞被MO感染后，細(xì)胞上清中TNF-α表達(dá)量有所上升(P<0.05)。

2.5 甘草酸對(duì)受MO感染后巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)的影響

為了研究MO對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，以及甘草酸在此過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase 3、caspase 8、caspase 9的表達(dá)情況(圖5)。結(jié)果顯示，與Control組相比巨噬細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因caspase 3的表達(dá)在MO感染后上調(diào)(P<0.000 1)，caspase 8無顯著變化(P=0.347 9)，caspase 9表達(dá)量下調(diào)(P<0.000 1)。與MO組相比受MO感染的巨噬細(xì)胞中經(jīng)甘草酸處理后caspase 3、caspase 8的表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.000 1)，caspase 9則無顯著變化(P=0.424 6)。

圖4 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的分泌Fig.4 Secretion of TNF-α in macrophage culture supernatant注： ***P <0.000 1 MO感染組 vs對(duì)照組；**P =0.009 7甘 草酸組 vs對(duì)照組；*P <0.05 MO感染組vs甘草酸+MO組。Note： ***P <0.000 1 MO treated vs Control；**P =0.009 7 glycyrrhizic acid treated vs Control； *P <0.05 MO treated vs glycyrrhizic acid+MO treated.

2.6 甘草酸對(duì)受MO感染后巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究MO對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，以及甘草酸在此過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bad的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)在MO感染后上調(diào)，而加入甘草酸處理不會(huì)引起正常巨噬細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)，但在受MO感染的巨噬細(xì)胞中，甘草酸不能改善MO引起的巨噬細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)(P= 0.076 3)。Bad蛋白在正常巨噬細(xì)胞中弱表達(dá)，在MO處理組中無表達(dá)，但甘草酸處理組表達(dá)量較高(P<0.000 1)。

圖5 凋亡相關(guān)基因在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況。Fig.5 Expression of apoptosis-related genes in macrophages.注：(Caspase 3)***P <0.000 1；(Caspase 8)P =0.347 9；(Caspase 9)****P <0.000 1 MO組vs Control。 (Caspase 3、Caspase 8)****P <0.000 1；(Caspase 9)P =0.424 6 MO/甘草組vs MO組。Note：(Caspase 3)***P <0.000 1；(Caspase 8)P =0.347 9；(Caspase 9)****P <0.000 1 MO treated vs Control.(Caspase 3、Caspase 8)****P <0.000 1；(Caspase 9)P =0.424 6 MO/ glycyrrhizic acid treated vs MO treated.

圖6 促凋亡因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況。Fig.6 Expression of pro-apoptotic factors in macrophages.(A) images of Western blot results.(B) quanlitative analysis of bands by ImageJ software.注：(Bax)P = 0.076 3 MO組 vs甘草酸/MO組；(Bad)****P <0.000 1 對(duì)照組vs甘草酸。Note：(Bax)P = 0.076 3 MO treated vs MO/ glycyrrhizic acid treated；(Bad)****P <0.000 1 Control vs glycyrrhizic acid treated.

2.7 甘草酸對(duì)受MO感染后巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)的影響

為了研究MO對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響，以及甘草酸在此過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR法檢測(cè)自噬相關(guān)基因Atg 7、Beclin 1的表達(dá)情況(圖7)。結(jié)果顯示，與Control組相比受MO感染的巨噬細(xì)胞中經(jīng)甘草酸處理后自噬相關(guān)基因Atg 7的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.000 1)，Beclin 1表達(dá)量顯著上調(diào)(P=0.001 6)；與MO組相比MO/甘草酸組自噬相關(guān)基因Atg 7、Beclin 1的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.000 1)。

3 討論

研究結(jié)果顯示，高濃度甘草酸溶液對(duì)細(xì)胞有抑制作用，但12 μmol/L甘草酸溶液可以促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖。以往研究發(fā)現(xiàn)支原體感染可使巨噬細(xì)胞活力下降，感染后期巨噬細(xì)胞凋亡，從而破壞宿主免疫系統(tǒng)對(duì)原發(fā)感染和繼發(fā)感染的控制，使得炎癥得以擴(kuò)散和蔓延[13]。甘草酸處理后細(xì)胞周期G1期、S期細(xì)胞數(shù)量減少，而進(jìn)入G2期的細(xì)胞數(shù)量增加，結(jié)合細(xì)胞增殖檢測(cè)，提示甘草酸可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞增殖，從而對(duì)巨噬細(xì)胞抗MO感染有一定積極作用。在細(xì)胞凋亡方面，caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，通過選擇性地切割某些蛋白質(zhì)使靶蛋白活化或失活，從而介導(dǎo)下游的細(xì)胞凋亡過程[14,15]。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了caspase家族的重要成員caspase 3，caspase 8，caspase 9在甘草酸參與的巨噬細(xì)胞應(yīng)對(duì)MO感染中的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草酸可以抑制凋亡基因caspase 3、caspase 8、caspase 9在正常巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。 蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)促凋亡因子Bax表達(dá)在正常組和甘草酸處理組均無明顯表達(dá)，而在MO處理后表達(dá)量明顯升高，提示MO感染可能會(huì)引起巨噬細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示甘草酸處理可以減少巨噬細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，從而增加MO處理后的巨噬細(xì)胞活性。

圖7 自噬相關(guān)基因在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.7 Expression of autophagy-related genes in macrophages注：(Atg 7)****P<0.000 1；(Beclin 1)**P =0.001 6 MO/甘草酸組 vs Control。(Atg 7、Beclin 1) ****P<0.000 1 MO/甘草酸組 vs MO組。Note：(Atg 7)****P<0.000 1；(Beclin 1)**P =0.001 6 MO/ glycyrrhizic acid treated vs Control.(Atg 7、Beclin 1) ****P<0.000 1 MO/ glycyrrhizic acid treated vs MO treated.

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MO可能通過抑制巨噬細(xì)胞自噬而減少巨噬細(xì)胞對(duì)MO的清除[5]。Bad蛋白在促凋亡和激活自噬中均發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)中Bad在正常組中表達(dá)，在甘草酸處理組中高表達(dá)，而在MO感染組中均無表達(dá)，提示甘草酸可能在激活巨噬細(xì)胞自噬中發(fā)揮作用。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證。自噬基因Beclin 1 和Atg 7表達(dá)變化說明，正常情況下甘草酸處理和甘草酸處理后經(jīng)MO感染情況下，都可以引起自噬相關(guān)蛋白編碼基因的高表達(dá)，結(jié)果提示甘草酸可能對(duì)巨噬細(xì)胞自噬有一定正向調(diào)控作用。

巨噬細(xì)胞可吞噬病原微生物，放大炎癥信號(hào)，并通過抗原遞呈調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答參與獲得性免疫應(yīng)答[16,17]。 TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞及NK細(xì)胞增殖活化[18,19]，及促進(jìn)單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937向巨噬細(xì)胞分化[20]，而且TNF-α能有效刺激肺泡上皮細(xì)胞A549產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MO可以抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，可能是MO對(duì)巨噬細(xì)胞免疫抑制的一個(gè)體現(xiàn)。然而甘草酸處理過的巨噬細(xì)胞在受到MO感染后，其TNF-α分泌量顯著回升。

綜上所述，甘草酸可以抑制受MO感染后巨噬細(xì)胞的凋亡，并且可以增加巨噬細(xì)胞增殖，而且甘草酸可以促進(jìn)受MO感染的巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α，除此之外，甘草酸可能通過對(duì)巨噬細(xì)胞自噬產(chǎn)生激活作用，從而在消除MO感染中發(fā)揮作用。