楊 旭，李 菁，孫先保，楊 柳，徐尚英，何述棟

（1.安徽新希望白帝乳業(yè)有限公司，安徽合肥 231600；2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥 230009；3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230009；4.安徽海神黃酒集團(tuán)有限公司，安徽合肥 231561）

國(guó)際糧農(nóng)組織的統(tǒng)計(jì)表明，蕓豆作為一種食用豆類作物，種植面積僅略低于大豆，位居第2位，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西北和西南等地區(qū)[1-3]。蕓豆的品種較多，根據(jù)顏色可分為白蕓豆、紅蕓豆、紫花蕓豆、黑蕓豆等。同時(shí)，蕓豆的營(yíng)養(yǎng)也較為豐富，蛋白質(zhì)含量約為23.1%，脂肪1.3%，碳水化合物56.9%，含鈣76 mg/100 g，以及豐富的B族維生素[4-5]，是一種比較難得的高鉀、高鎂、低鈉食品，氨基酸比例比較均衡[6]，可作為糧豆配合開發(fā)新營(yíng)養(yǎng)主食品種的原料，也是雜糧釀酒制醬的主要來源。近年來的蛋白質(zhì)功能性研究表明，白蕓豆蛋白質(zhì)中含有一種天然的α-淀粉酶抑制劑[7-8]，可以用來治療肥胖癥和糖尿病等[9]，并含有受到醫(yī)學(xué)界廣泛重視的花色苷、皂苷等有效成分，不僅可以提高人體免疫力、增強(qiáng)人體抗病能力，還對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用[10]。

與大分子蛋白相比，多肽具有可直接被機(jī)體吸收、消化利用率高、低免疫原性、促進(jìn)代謝的特點(diǎn)[11-13]，不論在營(yíng)養(yǎng)供給還是疾病治療方面都具有不可替代的作用[14]。然而，到目前為止，蕓豆蛋白的開發(fā)利用率還較低。以黑蕓豆蛋白為原料，采用酶解工藝制備黑蕓豆肽，并利用最佳水解條件下的產(chǎn)物研制具有抗氧化活性的黑蕓豆肽飲料，以期為蕓豆蛋白產(chǎn)業(yè)的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

小黑蕓豆，黑龍江黑土小鎮(zhèn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供；檸檬酸（食品級(jí)）、白砂糖；風(fēng)味蛋白酶（15 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；DPPH、無水乙醇、甲醛、氫氧化鈉，均為分析純。

PHS-3C型精密pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；752型紫外分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑蕓豆肽的制備

選擇顆粒飽滿、無蟲害的黑蕓豆進(jìn)行清洗，浸泡過夜，按料液比1∶8磨漿，過濾漿液，使其通過120目篩，分別收集豆?jié){和粗渣。將粗渣進(jìn)行二次磨漿、分離，最后去除豆渣。將經(jīng)上述處理后的黑蕓豆蛋白溶液水浴加熱至所需的溫度，調(diào)節(jié)pH值至設(shè)定值，加入相應(yīng)量的蛋白酶低速攪拌酶解。酶解時(shí)間結(jié)束后，立即置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻得到黑蕓豆肽溶液。

1.2.2 黑蕓豆肽飲料的制備

將上一步獲得的黑蕓豆肽溶液作為主要原料，加入適量的白砂糖、檸檬酸調(diào)味，進(jìn)行均質(zhì)處理，均質(zhì)溫度為60～65℃，均質(zhì)壓力為14.7 MPa，之后在121℃下殺菌15 min獲得終產(chǎn)品。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間為特征值（Xi），分別以酶解度和抗氧化性為響應(yīng)值（Yi），設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)分析點(diǎn)、5個(gè)零點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)5次，以估計(jì)誤差。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)黑蕓豆肽添加量（W/W，%）、加糖量（W/W，%）、檸檬酸添加量（W/W，%）進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。

黑蕓豆肽飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平見表2。

1.3 評(píng)價(jià)方法

表2 黑蕓豆肽飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平/%

1.3.1酶解度的測(cè)定——甲醛滴定法

用0.02 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至溶液顯微紅色，計(jì)算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克數(shù)。計(jì)算公式如下：

式中：Vsample——待測(cè)液消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積；

Vcontrol——對(duì)照液消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積；

nNaOH——標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的摩爾濃度。

1.3.2 抗氧化性的測(cè)定

用無水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。配置0.5 mg/mL的維C溶液（作為對(duì)照組）。將測(cè)試樣品稀釋至不同濃度。將2 mL測(cè)試樣品溶液及2 mL DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，于室溫下暗處靜置30 min后測(cè)定其吸光度Asample，同時(shí)測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL溶劑混合后的吸光度Acontrol，以及2 mL測(cè)試樣品溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。自由基清除能力的表示如下：

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

選擇并培訓(xùn)10名感官評(píng)定人員，在室溫下按參照GB 19302—2010制定的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表。

黑蕓豆飲料感官品質(zhì)評(píng)分見表3。

表3 黑蕓豆飲料感官品質(zhì)評(píng)分

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均平行測(cè)定至少3次，采用Design Expert 8.0.5.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析，通過Excel 2016軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蕓豆肽酶解條件的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

使用Design Expert V 8.0.5.0軟件，對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，分別得到各響應(yīng)值（Yi）對(duì)X1，X2，X3的回歸方程：

對(duì)以上回歸方程進(jìn)行方差分析。

黑蕓豆酶解產(chǎn)物的酶解度回歸方程方差分析見表5。

表5 黑蕓豆酶解產(chǎn)物的酶解度回歸方程方差分析

由表5可知，黑蕓豆酶解產(chǎn)物的酶解度的模型回歸項(xiàng)極顯著 （p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著 （p＞0.05），說明方程擬合接近實(shí)際?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.986 4，adjR2=0.968 9，說明試驗(yàn)誤差小，模型各項(xiàng)均達(dá)到理想水平，可以較好地反映因素與響應(yīng)值之間 的 關(guān) 系 。 方 程 中 X2， X3， X1X3， X2X3，，均為較顯著 （p＜0.05），X1，X1X2不顯著 （p＞0.05），說明試驗(yàn)因子與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。對(duì)回歸方程進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小得到各因素對(duì)酶解度的貢獻(xiàn)大小依次為X3（酶解時(shí)間） ＞X2（酶解溫度） ＞X1（酶添加量）。

黑蕓豆肽抗氧化性回歸方程方差分析見表6。

表6 黑蕓豆肽抗氧化性回歸方程方差分析

由表6可知，黑蕓豆肽抗氧化性的模型回歸項(xiàng)極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說明方程擬合接近實(shí)際?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.979 0，Adj R2=0.952 0，說明試驗(yàn)誤差小，模型各項(xiàng)均達(dá)到理想水平，可以較好地反映因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。方程中 X1，X2，X1X3，X2X3，均為較顯著 （p＜0.05），X3，X1X2不顯著 （p＞0.05），說明試驗(yàn)因子與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。對(duì)回歸方程進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小得到各因素對(duì)抗氧化性的貢獻(xiàn)大小依次為X2（酶解溫度） ＞X1（酶添加量） ＞X3（酶解時(shí)間）。

根據(jù)黑蕓豆肽酶解度和抗氧化性的響應(yīng)面回歸方程做響應(yīng)面圖，固定其中1個(gè)因素，考查另2個(gè)因素的交互作用。通過分析擬合響應(yīng)曲面的形狀和等高線的疏密，分析各因素對(duì)該指標(biāo)響應(yīng)值的影響情況，并進(jìn)一步確定黑蕓豆酶解的最佳工藝條件。

黑蕓豆蛋白酶解度響應(yīng)面圖見圖1，黑蕓豆肽抗氧化活性響應(yīng)面圖見圖2。

由圖1可見，隨著加酶量的增加，酶解度逐漸增大，當(dāng)加酶量達(dá)到4%時(shí)，酶解度的增大趨于平緩；隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解度先增大后減小，當(dāng)酶解時(shí)間為180 min時(shí)達(dá)到最大；隨著酶解溫度的增加，酶解度緩慢增大但不顯著，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50℃時(shí)，趨于最大值。由圖2可見，隨著酶添加量的增加，抗氧化性先增大后減小，當(dāng)酶添加量為4%時(shí)，抗氧化性最好；隨著酶解時(shí)間的增加，抗氧化性緩緩增大，但斜率很小，當(dāng)酶解時(shí)間為180 min時(shí)抗氧化活性的增長(zhǎng)趨于停滯；隨著酶解溫度的提高，抗氧化性先增大后減小，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，達(dá)到最大值。這說明黑蕓豆蛋白溶液的酶解度越高，其蛋白肽對(duì)DPPH自由基的清除能力越好，這與任海偉等人[15]的研究結(jié)果相一致。

綜合考慮各因素，最后確定酶添加量4%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間180 min為黑蕓豆肽酶解的最佳條件。

圖1 黑蕓豆蛋白水解度響應(yīng)面圖

圖2 黑蕓豆肽抗氧化活性響應(yīng)面圖

2.2 黑蕓豆肽飲料配方的正交結(jié)果分析

根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定黑蕓豆肽添加量60%，白砂糖添加量13%，檸檬酸添加量0.03%為較優(yōu)點(diǎn)，并在其附近取點(diǎn)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。

由表7可知，黑蕓豆肽、白砂糖、檸檬酸的添加量對(duì)黑蕓豆肽飲料的口感品質(zhì)均有不同程度的影響，其中黑蕓豆肽添加量是影響飲料品質(zhì)的顯著因子，各因素對(duì)黑蕓豆肽飲料口感品質(zhì)影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C。最佳的配料比工藝參數(shù)為A2B3C2，即黑蕓豆肽添加量為60%，白砂糖添加量為15%，檸檬酸添加量為0.03%，在此配料比下，研制的黑蕓豆肽飲料的口感效果最佳。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析。

正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析圖結(jié)果圖3。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果

圖3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析圖

由圖3可知，極差分析結(jié)果與正交試驗(yàn)表結(jié)果一致，各因素水平對(duì)因變量的影響較顯著。

3 結(jié)論

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)黑蕓豆肽制備的酶解工藝進(jìn)行了相應(yīng)面優(yōu)化，對(duì)黑蕓豆肽飲料的配方進(jìn)行了正交優(yōu)化。分別得到了酶解度和抗氧化性的響應(yīng)面模型方程，回歸方差分析表顯示黑蕓豆酶解產(chǎn)物的水解度的模型、抗氧化性模型的回歸項(xiàng)均極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)均不顯著（p＞0.05），各因素對(duì)酶解度的貢獻(xiàn)大小依次為X3（酶解時(shí)間）＞X2（酶解溫度）＞X1（酶添加量），對(duì)抗氧化性的貢獻(xiàn)大小依次為X2（酶解溫度） ＞X1（酶添加量） ＞X3（酶解時(shí)間）。綜合響應(yīng)面圖分析得黑蕓豆肽制備的最佳酶解工藝為酶添加量4%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間180 min。采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，黑蕓豆肽飲料的正交優(yōu)化結(jié)果表明，各因素對(duì)黑蕓豆肽飲料口感品質(zhì)影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C。最佳的配料比工藝參數(shù)為A2B3C2，即黑蕓豆肽添加量為60%，白砂糖添加量為15%，檸檬酸添加量為0.03%，在此配料比下研制的黑蕓豆肽飲料的口感效果最佳。