魏蘇萌,游 遠,楊玉玲,周 磊,李珊珊,王靜宇

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

雞肉中的脂肪含量較低,蛋白質(zhì)種類豐富,并且易被人體消化利用,是日常生活食品中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源[1]。其中,肌原纖維蛋白是動物肌肉中最重要的蛋白質(zhì),約占總蛋白含量的50%～55%[2]。而在肉制品貯藏和加工過程中常常發(fā)生脂肪氧化,脂肪氧化產(chǎn)生的自由基能導致肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)同時氧化,引起蛋白質(zhì)流變特性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,引起肉制品功能特性如保水性、乳化性和質(zhì)構(gòu)特性等發(fā)生改變[3-4]。有研究表明,氧化能夠使MP的G′發(fā)生變化。Liu等人[5]對雞胸肉MP通過自由基氧化體系(FeCl3/H2O2/抗壞血酸)進行氧化處理,發(fā)現(xiàn)隨著氧化時間從0 h到2 h再到24 h,MP的G′值顯著降低,并且凝膠形成區(qū)有了提前,凝膠形成區(qū)從未經(jīng)氧化處理的30～50 ℃提前到30～46 ℃,轉(zhuǎn)變處的溫度降低了3 ℃。

表1 不同濃度的牛血清蛋白溶液與蒸餾水的比例Table 1 The ratio of serum protein solution to distilled water in different concentrations

雖然氧化對MP凝膠特性的影響已有一些研究,但利用亞油酸-脂肪氧化酶體系研究氧化對MP凝膠特性與蛋白結(jié)構(gòu)的影響及其原因卻未見報道。與FeCl3+H2O2氧化體系相比,脂肪氧化酶是脂肪氧化的一種重要方式,氧化過程中會產(chǎn)生自由基和含羰基的化合物,引起蛋白質(zhì)氧化,從而改變MP凝膠特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與作用力。本文探討氧化對肌原纖維蛋白流變特性以及凝膠狀態(tài)下蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與疏水相互作用的影響,揭示氧化對凝膠流變學特性與蛋白二級結(jié)構(gòu)影響的原因,有助于推動凝膠氧化理論的完善,為肌原纖維蛋白凝膠特性控制和雞肉制品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活AA雞40日齡,20只,其中母雞和公雞各10只 購于南京青龍山養(yǎng)雞場,屠宰后取雞胸肉,在-18 ℃下儲存,于一個月內(nèi)使用;脂肪氧化酶LOX(1000000 U/mg)、亞油酸(色譜純) 均購于Sigma 公司;牛血清蛋白(BSA) 純度為99.9%,國藥集團化學試劑有限公司;其他化學試劑均為分析純。

PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司;TP-214電子分析天平 美國丹佛儀器公司;85-2恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司;722N 可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠;Avanti J-26XP高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;Anton Paar MCR302流變儀 奧地利安東帕有限公司;Labram HR800型激光拉曼譜儀 法國JY公司;F-7000熒光分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞胸肉中MP的提取 冷凍雞胸肉在室溫下解凍20 min,剔除結(jié)締組織和脂肪,并切成0.4～0.5 cm-3的切片,根據(jù)Xiong等[6]的方法低溫(4 ℃)提取肌原纖維蛋白。取40 g雞胸肉切碎,加入8倍分離緩沖液(0.1 mol·L-1KCl,2 mmol·L-1MgCl2,1 mmol·L-1EGTA,0.5 mmol·L-1DTT,10 mmol·L-1K2HPO4,pH7.0),在10000 r/min條件下分散10 s,間隔10 s,分散3次。在2000×g條件下離心20 min,棄上清,取沉淀。重復該步驟共3次。

加入8倍緩沖液(0.1 mol·L-1NaCl,1 mmol·L-1NaN3,pH6.0),10000 r/min分散10 s,分散1次后,用一層干燥潔凈的紗布過濾(使用之前煮沸),濾液在2000×g條件下離心20 min,棄上清,取沉淀。再重復該步驟共3次,得到肌原纖維蛋白沉淀。提取的蛋白質(zhì)在4 ℃下保存,3 d內(nèi)用完。

1.2.2 蛋白濃度的測定 參照楊玉玲等[7]采用雙縮脲法測定,以 BSA(牛血清蛋白)為標準蛋白[8]。

雙縮脲試劑的配制:稱取0.75 g CuSO4·5H2O,3 g C4H4O6KNa·4H2O,用適量的蒸餾水溶解,邊攪拌邊加入150 mL NaOH溶液,再加入0.5 g KI(防止Cu2+自動還原成Cu+),最后定容至500 mL,在塑料瓶中避光儲存。

標準曲線的制作:在室溫下避光靜置30 min后,于540 nm下測吸光度,制作標準曲線。

蛋白濃度的測定:取0.1 g MP置于7 mL離心管中,用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L KH2PO4,0.6 mol/L KCl,pH6.0)徹底溶解至10 mL,再加4 mL雙縮脲試劑混勻后,避光靜置30 min,在540 nm處測吸光度,記錄并根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。

1.2.3 MP的氧化處理 將MP用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L KH2PO4,0.6 mol/L KCl,pH6.0)溶解,稀釋至質(zhì)量濃度為25 mg/mL的MP溶液,向其中分別加入0、0.2、1、2、4、10 mmol/L亞油酸溶液,分別加入5000 U/mL脂肪氧化酶,在4 ℃下氧化24 h,用1 mmol/L EDTA終止氧化,得到經(jīng)過氧化處理的MP樣品[9]。配制濃度為25 mg/mL的MP蛋白溶液用于流變特性、二級結(jié)構(gòu)的測定,10 mg/mL的MP蛋白溶液用于表面疏水性的測定。

1.2.4 MP流變特性的測定 將氧化后的MP樣品置于流變儀操作臺,用流變儀測定G′和G″。流變儀設定條件:直徑為50 mm平行板,狹縫0.5 mm,應變2%,頻率0.1 Hz。升溫速率1 ℃/min,升溫范圍20～80 ℃,記錄G′。

1.2.5 MP凝膠二級結(jié)構(gòu)的測定 氧化處理后的MP樣品水浴加熱至70 ℃(1 ℃/min)制成凝膠,保溫20 min,取出后自然冷卻,4 ℃保存16 h后備用。用Labram HR800激光拉曼光譜儀對MP樣品進行測量,激光波長:514.5 nm;激光出射功率:10 mW(照到樣品上約4 mW);顯微物鏡:50倍長焦距;光柵:600;狹縫(Hole):200 μm;積分時間:60 s;重復三次累加得譜。測試完成后用儀器自帶的軟件Labspec對光譜進行平滑,多點基線校正去除熒光背景。根據(jù)苯丙氨酸環(huán)在1003 cm-1伸縮振動的強度作為內(nèi)標進行歸一化[10](它的強度不隨蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化而變化)。用酰胺I譜1655±5 cm-1帶強度表征α-螺旋含量;1670±5 cm-1、1680 cm-1處強度和1665±5 cm-1強度分別表征β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量[11]。

1.2.6 MP凝膠表面疏水性的測定 將氧化處理后的MP樣品置于7 mL離心管中,從25 ℃升溫至70 ℃水浴加熱制成凝膠,升溫速率1 ℃/min,之后保溫20 min,取出后自然冷卻,4 ℃保存16 h后使用。用緩沖溶液將MP樣品稀釋至0.125、0.25、0.5、1 mg/mL。取2 mL稀釋液,加入10 μL 含8 mmol/L ANS、0.1 mol/L K2HPO4的緩沖液(pH7.0),混勻,黑暗中靜置10 min后用于測定表面疏水性。熒光分光光度計的激發(fā)波長為374 nm,發(fā)射波長為485 nm。以熒光強度對蛋白濃度作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(S0-ANS)。

1.2.7 統(tǒng)計分析 用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白濃度測定結(jié)果

圖1為牛血清蛋白的標準曲線,方程為y=0.021x+0.0898,R2=0.9996。依據(jù)文中方法,測得所提取的蛋白濃度為105.5 mg/mL。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Protein standard curve of BSA

2.2 氧化對MP流變性的影響

氧化對肌原纖維蛋白流變性的影響如圖2所示。由圖2可知,隨著溫度的升高(20～50 ℃),除了經(jīng)過10 mmol/L亞油酸氧化處理的MP樣品,其他MP樣品均在43 ℃左右開始溶液向凝膠的轉(zhuǎn)變,這一階段G′的升高是由肌球蛋白頭部S1亞基變性引起的;MP樣品在50 ℃到達凝膠減弱區(qū),Control、0.2、1、2、4和10 mmol/L的MP樣品的G′都在50 ℃達到第一個最大值,分別為133.87、94.7、98.84、135.17、118.33和50.20 Pa。與對照組相比,隨著處理濃度的增加,MP樣品的G′值(50 ℃)先上升而后急劇下降,在2 mmol/L處達到最大值,并且表現(xiàn)出顯著性差異(表2)。隨著溫度的繼續(xù)升高(50～55 ℃),G′開始降低,可能是由于在這一溫度范圍下,MP分子展開速率快，導致MP分子流動性增大,從而影響了樣品的G′。隨著溫度的繼續(xù)升高(55 ℃以上),MP樣品進入凝膠增強區(qū),G′再次開始升高,熱誘導凝膠逐漸形成。不同濃度處理下MP樣品加熱終點(80 ℃)的G′值見表2,且與50 ℃時MP樣品的G′值的變化趨勢一致。

表2 不同氧化程度處理下肌原纖維蛋白50、80 ℃處儲能模量值的統(tǒng)計顯著性分析Table 2 Statistical significance analysis of storage modulus values of MP at 50,80 ℃ under different degrees of oxidation

圖2 氧化對肌原纖維蛋白G′的影響Fig.2 Effect of oxidation on G′ of MP samples

結(jié)果表明,氧化改變了雞胸肉肌原纖維蛋白的流變特性。在50 ℃時,亞油酸濃度為2 mmol/L的MP樣品的G′值最大,而且在凝膠增強區(qū)(>68 ℃),2 mmol/L樣品的G′值呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢,表明添加亞油酸量為2 mmol/L時,MP凝膠的成膠能力最強。10 mmol/L亞油酸處理的MP樣品在41 ℃左右開始溶液向凝膠的轉(zhuǎn)變,比其他樣品都早,可能是因為在高氧化程度下,蛋白質(zhì)變性速度更快,且有更多的脂質(zhì)氧化二級產(chǎn)物的產(chǎn)生,導致了溶液向凝膠這一轉(zhuǎn)變的提前。Liu等[12]也發(fā)現(xiàn),經(jīng)過H2O2+FeCl3氧化處理的肌原纖維蛋白凝膠轉(zhuǎn)變溫度提前,G′更低。

2.3 氧化對凝膠中MP分子結(jié)構(gòu)的影響

MP分子的拉曼光譜在1600～1700 cm-1附近的條帶是屬于酰胺帶I的伸縮振動,主要原因是脂肪族仲酰胺的C=O的伸縮振動,以及還有部分來源于Cα-C-N的彎曲振動、C-N的伸縮振動以及N-H的面內(nèi)彎曲振動[13-14]。酰胺帶I處振動是與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)密切相關,包括主要集中在1655±5 cm-1處的高α-螺旋含量的酰胺I帶振動,主要集中在1670±5 cm-1處的高β-折疊含量的酰胺I帶振動,此外還有1680 cm-1處的β-轉(zhuǎn)角和1665±5 cm-1處的無規(guī)則卷曲[11]。通過酰胺帶I最大峰的波數(shù)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行定量分析[15]。

在脂質(zhì)酶氧化體系中,不同氧化程度對肌原纖維蛋白分子二級結(jié)構(gòu)影響的譜圖見圖3,對圖3進行分析得到不同亞油酸濃度下蛋白質(zhì)四種二級結(jié)構(gòu)百分比的變化情況(見圖4)。在對照組中,二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量最多;加入亞油酸后,α-螺旋含量從未氧化時的48.31%一直降低,到亞油酸10 mmol/L時降到最低29.57%,而β-折疊含量則從14.75%緩慢升高到22.14%,β-轉(zhuǎn)角含量也隨著氧化程度的升高從16.28%增加到21.88%,無規(guī)則卷曲的含量總體呈現(xiàn)升高的趨勢。表明α-螺旋有可能轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角,致使α-螺旋含量下降,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量上升。

圖4 二級結(jié)構(gòu)變化情況Fig.4 The changes of secondary structure

吳偉[16]在研究經(jīng)過氧化處理的大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化時發(fā)現(xiàn),氧化會使大豆蛋白的α-螺旋和β-折疊含量下降,在本實驗中,氧化導致α-螺旋下降,但是β-折疊含量升高,可能是因為其大豆蛋白是植物蛋白而本實驗中的MP是肉類蛋白,二者結(jié)構(gòu)不同導致。Tamamizu等人[17]也曾研究發(fā)現(xiàn),丙烯醛氧化會導致阿樸脂蛋白-3N端結(jié)構(gòu)域α-螺旋含量降低。楊玉玲等[7]研究加熱過程中肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化時發(fā)現(xiàn),β-折疊含量的增加是導致凝膠的G′增加的關鍵原因。

2.4 氧化對MP凝膠疏水相互作用的影響

如圖5所示,當亞油酸含量為0～2 mmol/L時,隨著濃度增加,S0-ANS升高,在2 mmol/L處達到最大值,隨著氧化程度的增強(2～10 mmol/L),S0-ANS降低。結(jié)果表明,MP的表面疏水性在低氧化程度下(0～2 mmol/L)逐漸升高,但在高氧化程度下(2～10 mmol/L)逐漸降低。Li等[18]用ANS探針法研究經(jīng)過氧化處理的肌球蛋白疏水性的變化,發(fā)現(xiàn)表面疏水性隨著氧化程度的增加而增加,其使用的氧化體系是FeSO4-抗壞血酸氧化體系,且氧化體系的孵化時間也與本研究有差異。也有研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)氧化會導致表面疏水性的降低[19]。Gao等人[20]發(fā)現(xiàn),肌原纖維蛋白在65～70 ℃時,疏水性氨基酸的暴露程度最大,陳瓊[21]也得出類似的結(jié)論。

圖5 S0-ANS隨亞油酸濃度的變化Fig.5 Changes of S0-ANS with linoleic acid concentration 注:同一條曲線上不同小寫字母(a～c)表示處理間差異顯著(p<0.05)。

蛋白質(zhì)表面疏水性的增加是由于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團暴露,從而使蛋白質(zhì)分子的疏水基團更易于聚集交聯(lián),疏水相互作用得到增強,ANS也可以更多地與蛋白質(zhì)疏水基團結(jié)合,所以S0-ANS值可用于表征疏水相互作用,其值越高,表示疏水相互作用越強。在MP凝膠的形成過程中,隨著氧化程度的升高(0～2 mmol/L),MP分子部分展開,這使得疏水性基團暴露,導致疏水相互作用增強;在亞油酸濃度為2 mmol/L時,疏水基團的暴露程度最高,疏水相互作用達到最大;隨著亞油酸濃度繼續(xù)增大(2～10 mmol/L),蛋白質(zhì)氧化程度逐漸升高,可能部分疏水性基團又被包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部,導致疏水相互作用的降低。蛋白質(zhì)氧化改變了MP凝膠的疏水相互作用,疏水相互作用的變化可能引起MP的G′和二級結(jié)構(gòu)的變化。在2 mmol/L時,MP凝膠的疏水相互作用最大,此時MP的G′值(>68 ℃)也最大,表明疏水基團的暴露、疏水相互作用的增加可能導致了MP的G′值的上升;α-螺旋是依靠MP分子內(nèi)氫鍵形成的,β-折疊是依賴蛋白質(zhì)分子間氫鍵形成的。從總含量變化上看,氧化導致MP分子內(nèi)氫鍵降低,分子間氫鍵增加,但MP凝膠中氫鍵總含量降低。隨著氧化程度的增加,蛋白質(zhì)分子中的氫鍵作用遭到破壞,分子間的相互作用逐漸變?nèi)?蛋白質(zhì)氧化可能導致蛋白內(nèi)的疏水結(jié)合被打破,導致蛋白質(zhì)分子展開,蛋白內(nèi)部的疏水性基團暴露出來,導致MP凝膠的疏水相互作用發(fā)生變化,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,致使MP凝膠中的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,α-螺旋含量一直降低,β-折疊含量緩慢升高,β-轉(zhuǎn)角含量也隨著氧化程度的升高而增加,無規(guī)則卷曲的含量總體呈現(xiàn)升高的趨勢。

3 結(jié)論

氧化能夠改變肌原纖維蛋白的G′及其凝膠中蛋白的二級結(jié)構(gòu)和疏水相互作用。在亞油酸濃度為2 mmol/L時,MP的G′值(>68 ℃)均大于對照組和其他濃度的處理組,表明適度氧化(2 mmol/L)能夠提高MP的G′,提升MP凝膠的成膠能力,而其他處理樣品的G′在相同溫度下均低于對照樣的G′。經(jīng)過氧化處理,α-螺旋含量一直降低,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量上升,β-折疊含量的增加有可能是導致凝膠的G′增加的關鍵結(jié)構(gòu)。MP凝膠的表面疏水性隨氧化程度的增加先上升后下降,在2 mmol/L處達到最大,表明此時疏水性基團的暴露程度最大,疏水相互作用最強,同時MP的G′值(>68 ℃)在2 mmol/L時達到最大,表明疏水相互作用的變化可能是影響MP凝膠中的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的原因。