王 夢,張澤生,劉 暄,李雨蒙,張文菱子

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

糖尿病已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后世界第三大非傳染性疾病,嚴(yán)重影響到人們的正常生活,威脅著人類的健康[1]。2 型糖尿病是一種復(fù)雜的代謝紊亂疾病,主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體胰島β細(xì)胞受損,患者出現(xiàn)胰島素抵抗導(dǎo)致機(jī)體血糖水平上升[2]。胰島素抵抗是指胰島素效應(yīng)器官對胰島素的敏感性下降,主要是指外周靶器官對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖代謝作用不敏感的狀態(tài)[3]。

D-松醇是D-手性肌醇的一種甲基化衍生物,在植物中含量十分豐富。目前制備方法有從天然植物中提取和化學(xué)合成等方法[4-9]。D-松醇具有類胰島素的作用,它能夠通過提高機(jī)體對胰島素的敏感程度來緩解機(jī)體胰島素抵抗現(xiàn)象,調(diào)控機(jī)體血糖水平,而且D-松醇在促進(jìn)胰島素功能的同時(shí)還可以為機(jī)體傳輸營養(yǎng)物質(zhì)[10-12]。此外,D-松醇還可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰腺組織、肝臟、腎臟,修復(fù)由糖尿病引起的肝、腎功能損傷[13-14]。有研究表明,D-松醇可與肝細(xì)胞受損后產(chǎn)生的半乳糖胺在Mn2+的螯合作用下結(jié)合,形成胰島素第二信使[15],改善胰島素抵抗癥狀。而D-松醇復(fù)配Mn2+的降血糖效果和機(jī)制研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型,探究 D-松醇復(fù)配Mn2+后的降血糖作用效果,并初步探討其作用機(jī)制,為預(yù)防或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SPF級大鼠 85只,體重(200±20) g,斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證編號[SCXK(京)2016-0002];D-松醇(純度95%) 西安一品生物技術(shù)有限公司;食品級MnSO4科漢森(天津)食品添加劑公司;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼料 斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司;STZ 北京索萊寶科技有限公司;大鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒、糖化血清蛋白試劑盒 南京建成生物工程研究所;鹽酸吡格列酮 北京太洋藥業(yè)股份有限公司;高糖高脂飼料 為實(shí)驗(yàn)室自制,高脂高糖飼料配方為:50%基礎(chǔ)飼料、22%白砂糖、15%豬油、9%酪蛋白、1%明膠、0.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、1% 礦物質(zhì)、1% 維生素。

OneTouch血糖儀 英國強(qiáng)生公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀 瑞士Mettler Toledo公司;GLM-17R冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物始終飼養(yǎng)于清潔級動(dòng)物房中(環(huán)境設(shè)施合格證號:SYXK(津)2006-0005),并保證實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水、進(jìn)食,保持室內(nèi)環(huán)境溫度為(22±2) ℃、濕度為40%～60%、12 h光照明暗交替。85只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)選取15只禁食12 h,測空腹血糖,作為該批次動(dòng)物基礎(chǔ)血糖值。之后對大鼠進(jìn)行稱重,按體重?zé)o顯著性差異進(jìn)行分組,分空白組(15只)、模型組(70 只)?？瞻捉M喂飼正常飼料,模型組喂飼高脂高糖飼料,持續(xù)4周。

本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ)溶液建立2型糖尿病模型。稱取200 mg STZ在冰浴中溶于10 mL pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,緩沖液濃度為0.1 mol/L,配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液。根據(jù)大鼠體重,按30 mg/kg 的劑量腹腔注射STZ溶液。正常組大鼠根據(jù)體重給予同等體積比例的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。注射STZ溶液72 h后對模型組大鼠進(jìn)行空腹血糖(FBG)測定,大鼠空腹血糖值在16.7 mmol/L

1.2.2 動(dòng)物分組及降血糖實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 動(dòng)物分組 將60只造模成功大鼠按空腹血糖水平無顯著性差異分為6組,即模型對照組(DC)、D-松醇劑量組(DP)、D-松醇復(fù)配MnSO4低劑量組(LPM)、D-松醇復(fù)配MnSO4中劑量組(MPM)、D-松醇復(fù)配MnSO4高劑量組(HPM)、陽性對照組(PC),每組10只。再選取同一批次的正常大鼠10只作為空白對照組(NC),開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。期間保證各組大鼠自由飲水、攝食,每天觀察大鼠精神狀況、活動(dòng)、飲食、飲水、體毛色澤等情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Experimental design scheme

1.2.2.2 受試樣品對T2DM大鼠體重的影響 灌胃干預(yù)期為5周,期間每周固定時(shí)間對各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行體重的測定。

1.2.2.3 受試樣品對T2DM大鼠空腹血糖(FBG)的影響 灌胃干預(yù)期為5周,期間每周固定時(shí)間對各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行空腹血糖(FBG)的測定。大鼠禁食不禁水12 h后尾靜脈取血,用血糖儀測定并記錄空腹血糖值,實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后比較各組大鼠血糖值及血糖下降率。

血糖下降率(%)=(實(shí)驗(yàn)前血糖值-實(shí)驗(yàn)后血糖值)/實(shí)驗(yàn)前血糖值×100

1.2.2.4 受試樣品對T2DM大鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)的影響 灌胃干預(yù)4周后,對各組大鼠進(jìn)行葡萄糖耐量(OGTT)測定。禁食不禁水12 h 后,劑量組大鼠給予不同濃度的受試樣品,模型對照組大鼠給予同體積蒸餾水。20 min后經(jīng)口灌胃葡萄糖溶液2.0 g/kg·d,測定此時(shí)大鼠的血糖值(即給予葡萄糖0 h時(shí)的血糖值),之后分別測定大鼠0.5、1.0和2.0 h時(shí)的血糖值。分析比較各組大鼠在給予葡萄糖后0.5、1.0、2.0 h的血糖值并繪制血糖變化曲線、根據(jù)公式[16]計(jì)算血糖變化曲線下面積(AUG)。

AUG(mmol/L)=[(0 h血糖+0.5 h血糖)×0.5]/2+[(1 h血糖+0.5 h血糖)×0.5]/2+[(1 h血糖+0.5 h血糖)×0.5]/2

式(1)

表2 全定量PCR引物設(shè)計(jì)序列Table 2 Real-time PCR primer design sequence

1.2.2.5 受試樣品對T2DM大鼠胰島素耐量(ITT)的影響 在口服糖耐量實(shí)驗(yàn)測試結(jié)束72 h后,對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行胰島素耐量的測定。禁食不禁水12 h后,劑量組給予不同濃度的受試樣品,模型對照組給予同體積蒸餾水。20 min后皮下注射0.15 U/kg胰島素,測定此時(shí)大鼠的血糖值(即注射胰島素 0 h時(shí)的血糖值),而后繼續(xù)測定注射胰島素后0.5、1.0和2.0 h的血糖值。觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射胰島素后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值并繪制血糖變化曲線、計(jì)算血糖變化曲線下面積(公式同式1)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠生理指標(biāo)檢測方法

1.2.3.1 空腹血清胰島素(FINS)水平的測定 本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測法測定大鼠FINS的含量。試劑盒操作方法參照南京建成大鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明書進(jìn)行測定。

1.2.3.2 胰島素敏感性指數(shù)(ISI)和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)測定 通過檢測得知大鼠FINS后配合FBG值計(jì)算胰島素敏感指數(shù)以評價(jià)大鼠組織對胰島素的敏感程度，計(jì)算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)以評價(jià)受試大鼠胰島細(xì)胞分泌能力。

ISI計(jì)算公式為ISI=Ln1/INS×BG

HOMA-β計(jì)算公式為HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)

1.2.3.3 糖化血清蛋白(GSP)含量的測定 糖化血清蛋白(GSP)含量測定又稱糖胺含量測定,血漿中的葡萄糖與一些蛋白分子氮端非酶促結(jié)合形成糖胺物質(zhì),糖胺的形成與血糖濃度呈正相關(guān)。試劑盒操作方法按照南京建成糖化血清蛋白試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光全定量分析(RT-PCR)實(shí)驗(yàn) 將大鼠肝臟在液氮中研磨至粉末,后采用Trizol法[16]提取肝臟RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,再利用Real-time PCR 法[16]以GADPH為看家基因,檢測IRS-1、IRS-2、AMPKα-1、AMPKα-2、PGC-1、PEPCK、G6Pase、GLUT4基因mRNA表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”(Mean±SD)表示,采用Duncans(Duncans Multiple Range Tests)進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。組間分析采用t檢驗(yàn),p<0.05表示兩組之間具有顯著性差異,p<0.01表示兩組之間具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外貌形態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)過程中對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的外貌、體態(tài)進(jìn)行觀察記錄。N組的健康大鼠,體型勻稱、毛發(fā)順暢且有光澤,運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)、飲食飲水量正常。糖尿病大鼠體型明顯消瘦、毛發(fā)蓬亂且無光澤,運(yùn)動(dòng)能力差,并且出現(xiàn)飲食飲水量增加、排尿量增大的現(xiàn)象。

2.2 受試樣品對T2DM大鼠體重變化的影響

糖尿病患者最直觀的病癥是患者的體重明顯降低。給予受試樣品期間,每周對實(shí)驗(yàn)大鼠的體重進(jìn)行測定,結(jié)果如表3。

由表3可知,與健康大鼠相比,患病大鼠的體重極顯著性的降低,因?yàn)榛疾〈笫笥捎跈C(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗,機(jī)體不能充分利用葡萄糖,使脂肪和蛋白質(zhì)分解加速來補(bǔ)充能量和熱量,導(dǎo)致機(jī)體體重減輕。給予受試樣品的大鼠在經(jīng)過一段時(shí)間的干預(yù)之后體重有增長的趨勢。DC組與NC組相比,大鼠體重具有極顯著性的降低(p<0.01);DP組、LPM組和MPM組的大鼠體重與DC組相比,第五周有顯著性升高趨勢(p<0.05);HPM組和PC組的大鼠體重與DC組相比,從第三周開始出現(xiàn)顯著性升高趨勢(p<0.05),在第五周出現(xiàn)極顯著性升高趨勢(p<0.01)。

表3 各組大鼠的體重變化(Mean±SD,n=10)Table 3 Body weight change in experimental rats(Mean±SD,n=10)

2.3 受試樣品對T2DM大鼠FBG變化的影響

糖尿病患者最直觀的病癥是患者的空腹血糖值明顯升高且長期維持在一個(gè)相對較高的水平,給予受試樣品期間,每周對實(shí)驗(yàn)大鼠的空腹血糖值進(jìn)行測定,結(jié)果如表4所示。

表4 各組大鼠空腹血糖值的變化(Mean±SD,n=10)Table 4 FBG change in experimental rats(Mean±SD,n=10)

由表4可知,造模成功后,DC組大鼠FBG值與NC組相比極顯著性升高(p<0.01);與DC組相比,給予受試樣品5周后,DP組、LPM組和MPM組大鼠FBG值顯著下降(p<0.05),下降率分別為7.44%、9.47%和11.24%,給予受試樣品3周后,HPM組和PC組大鼠FBG值顯著下降(p<0.05),且在第五周極顯著下降(p<0.01),下降率分別為18.73%和22.54%。說明D-松醇復(fù)配Mn2+能更好的調(diào)控2型糖尿病大鼠空腹血糖水平,達(dá)到降血糖作用。

2.4 受試樣品對T2DM大鼠OGTT變化的影響

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)是一種檢測機(jī)體對葡萄糖耐受能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn),是一個(gè)非常精細(xì)的變化過程。對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行口服糖耐量測試,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(A、B)所示。

圖1 受試樣品對T2DM大鼠OGTT的影響(Mean±SD,n=10)Fig.1 Effect of fermented beverage on OGTT in T2DM rats(Mean±SD,n=10)

由圖1A可知,NC組大鼠在給予葡萄糖溶液后血糖值于0.5 h達(dá)到頂峰,在2.0 h時(shí)回落至初始值附近;DC組大鼠在給予葡萄糖溶液后血糖值于0.5 h達(dá)到頂峰,在2.0 h時(shí)回落至初始值附近,但仍然維持一個(gè)較高的血糖水平;各劑量組大鼠血糖值有明顯回落至初始值的趨勢,且HPM組和PC組大鼠血糖值有所降低。經(jīng)過AUG可得圖1B結(jié)果,DC組大鼠血糖曲線下面積極顯著大于NC組(p<0.01);各劑量組大鼠血糖變化曲線下面積較DC組極顯著性減小(p<0.01),且MPM組和HPM組較DP組顯著性減小(p<0.05)。

2.5 受試樣品對T2DM大鼠ITT變化的影響

胰島素耐量實(shí)驗(yàn)考察機(jī)體對胰島素的敏感程度,對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行胰島素耐量測試,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(A、B)所示。

圖2 受試樣品對T2DM大鼠ITT的影響(Mean±SD,n=10)Fig.2 Effect of fermented beverage on ITT in T2DM rats(Mean±SD,n=10)

如圖2A所示,劑量組大鼠皮下注射胰島素后0.5 h時(shí),HPM 組血糖下降率有明顯上升趨勢。經(jīng)過計(jì)算血糖變化曲線下面積可得如圖2B,DC組大鼠曲線下面積極顯著性的大于正常對照組(p<0.01);MPM組血糖變化曲線下面積與 DC組比較,出現(xiàn)顯著性減小(p<0.05),且HPM組和PC組出現(xiàn)極顯著性減小(p<0.01)。

2.6 受試樣品對T2DM大鼠FINS、ISI和HOMA-β的影響

2型糖尿病患者血糖水平處在一個(gè)相對較高的狀態(tài),這一現(xiàn)象并非都是因?yàn)橐葝u細(xì)胞受損導(dǎo)致胰島素分泌不足引起的,大部分是由于機(jī)體對胰島素的敏感性下降,因而導(dǎo)致胰島素利用率下降,出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象。因此,持續(xù)的高血糖水平會(huì)反饋調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞不斷分泌胰島素,使患者的空腹血清胰島素含量較高,使機(jī)體對胰島素的敏感性降低。

由表5可知,大鼠患糖尿病后FINS極顯著性升高(p<0.01),ISI和HOMA-β極顯著性降低(p<0.01),各劑量組FINS與DC組相比具有極顯著性差異(p<0.01),HPM組FINS 極顯著性低于DP組(p<0.01)。MPM組和HPM組ISI與DC組相比均有顯著性升高(p<0.05)。HOMA-β呈升高趨勢,有效減少肝糖輸出,抑制胰島素抵抗,且HPM組與DC組相比顯著性升高(p<0.05)。

表5 各受試樣品對T2DM大鼠FINS、ISI和HOMA-β的影響(Mean±SD,n=10)Table 5 Effects of tested samples on FINS、ISI and HOMA-β of experimental rats(Mean±SD,n=10)

2.7 受試樣品對T2DM大鼠GSP的影響

GSP是一種由血漿中的葡萄糖與一些蛋白分子氮端非酶促結(jié)合形成的糖胺物質(zhì)。由于這種糖胺結(jié)構(gòu)有20 d左右半衰期,所以GSP水平可以評價(jià)患者在一段時(shí)間內(nèi)的平均血糖水平[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 受試樣品各組大鼠GSP含量的影響(Mean±SD,n=10)Fig.3 Effect of fermented beverage on GSP in T2DM rats(Mean±SD,n=10)

由圖3可知,DC組大鼠GSP含量與NC組相比極顯著性升高(p<0.01),受試樣品干預(yù)5周后,各劑量組大鼠GSP含量相對DC組極顯著性下降(p<0.01),HPM組大鼠GSP含量相較于DP組極顯著性降低(p<0.01)。

2.8 受試樣品對T2DM大鼠相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4可知,與模型組相比,各劑量組ISI-1、ISI-2和AMPKα-2基因mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(p<0.05),且高劑量組與D-松醇組相比極顯著性上調(diào)(p<0.01)。高劑量復(fù)配組AMPKα-1和GLUT4基因mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(p<0.05),PGC-1α、PEPCK和G6Pase基因mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(p<0.05)。IRS-1和IRS-2是胰島素受體信號耦聯(lián)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,當(dāng)胰島素與受體結(jié)合后,可激活I(lǐng)RS分子,而IRS表達(dá)水平的高低是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)正常與否的基礎(chǔ),當(dāng)IRS的濃度下降到一定程度,胰島素信號的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)就會(huì)受到阻滯[18-19]。AMPK對糖代謝具有廣泛的影響,在促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),加強(qiáng)糖酵解以及抑制糖異生[20-21]等生化反應(yīng)中均發(fā)揮一定功能。促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)主要由GLUT4完成,AMPK可誘導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)位,還可激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,在基因水平增加GLUT4的表達(dá),最終達(dá)到促進(jìn)外周組織攝取葡萄糖的目的[22]。PGC-1α水平增加激活糖異生關(guān)鍵酶造成肝糖輸出的增加,維持空腹血糖穩(wěn)定,進(jìn)而阻止機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗。G6Pase是催化6-磷酸葡萄糖水解為葡萄糖的關(guān)鍵酶,該反應(yīng)是糖原分解和糖異生的最后一步反應(yīng),它的過度表達(dá)與激活將導(dǎo)致機(jī)體血糖升高。而PEPCK作為催化糖異生反應(yīng)第一步的關(guān)鍵酶,其表達(dá)及活力變化對糖異生起到重要的調(diào)節(jié)作用[23-24]。

圖4 受試樣品對T2DM大鼠AMPK相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響(Mean±SD,n=10)Fig.4 Effects of test samples on the expression level of AMPK related gene mRNA in T2DM rats(Mean±SD,n=10)

3 結(jié)論

D-松醇與半乳糖胺在Mn2+的螯合作用下以1∶1的摩爾分子量比例形成胰島素第二信使。與模型對照組相比,各劑量組均可顯著性降低T2DM大鼠空腹血糖值(p<0.05),而高劑量復(fù)配組血糖值極顯著降低(p<0.01)。結(jié)果表明D-松醇復(fù)配Mn2+對T2DM大鼠空腹血糖水平具有一定的調(diào)控能力,起到降低血糖的效果。通過OGTT實(shí)驗(yàn)評價(jià)受試動(dòng)物急性降糖能力,結(jié)果表明,復(fù)配組優(yōu)于單一D-松醇組改善T2DM大鼠機(jī)體對葡萄糖的耐受能力,以及改善其對胰島素的敏感程度,進(jìn)而起到的胰島素促敏劑作用[25]。此外,與D-松醇組相比,高劑量復(fù)配組的FINS和GSP極顯著降低(p<0.01),表明D-松醇復(fù)配Mn2+比單一D-松醇更好的緩解了大鼠外周組織的胰島素抵抗,增加了受體對胰島素的結(jié)合能力[26]。與模型對照組相比,ISI-1、ISI-2和AMPKα-2基因mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(p<0.05),且高劑量組與D-松醇組相比極顯著性上調(diào)(p<0.01)。高劑量復(fù)配組AMPKα-1和GLUT4基因mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(p<0.05),PGC-1α、PEPCK和G6Pase基因mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(p<0.05)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為D-松醇復(fù)配Mn2+的降血糖作用提供科學(xué)依據(jù),但本次研究只局限于生理表層和基因表達(dá)方面,將來更需要通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對降血糖機(jī)制進(jìn)一步評價(jià)分析,為D-松醇在食品工業(yè)中的研究開發(fā)提供進(jìn)一步的理論幫助。