周小丹，羅金，漆倩榮，謝青貞，鐘方圓，梅憶媛，張祎明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

卵泡是卵巢的基本功能單位，而顆粒細(xì)胞是附著在卵泡腔卵母細(xì)胞周圍，構(gòu)成卵泡的最大細(xì)胞群，是卵巢分泌甾體激素的主要功能細(xì)胞。顆粒細(xì)胞通過間隙鏈接和旁分泌因子影響卵泡及卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育、成熟[1-2]。目前，已有不同研究報(bào)道分離提取人卵巢顆粒細(xì)胞的各種方法，但結(jié)論并不一致。國內(nèi)有部分研究提出了使用紅細(xì)胞裂解法[3-4]，但是國外多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究仍以密度梯度離心法作為基本方法[5-6]，兩者各具優(yōu)、缺點(diǎn)。因此，如何有效提取原代顆粒細(xì)胞仍是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，本文分別選擇這兩種方法及聯(lián)合這兩種方法進(jìn)行提取人卵巢顆粒細(xì)胞，從細(xì)胞獲取量、存活率、貼壁及細(xì)胞生長情況進(jìn)行比較，為建立分離培養(yǎng)顆粒細(xì)胞方法提供更多選擇和依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

選取2018年3～4月在我院生殖中心接受IVF-ET治療的20例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡21～38歲；月經(jīng)第2～3天基礎(chǔ)性激素水平正常；月經(jīng)第3天竇狀卵泡數(shù)在6～20個(gè)之間；因輸卵管梗阻或男方因素導(dǎo)致不育；獲卵數(shù)>6枚；采卵前陰道分泌物霉菌、滴蟲檢查正常。所有患者均采用黃體期長方案降調(diào)節(jié)，采卵日收集穿刺取卵和撿卵后廢棄的卵泡液。本研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；紅細(xì)胞裂解液、Percoll分離液購自武漢Biosharp公司；胎牛血清購自新西蘭Gibco公司；臺盼藍(lán)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；胰酶、PBS緩沖液購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；FSHR抗體購自美國Santa Cruz公司；CCK8試劑盒購自日本同仁。

二、方法

1.材料收集：收集我院采卵患者在B超下經(jīng)陰道穿刺卵泡獲得的卵泡液，以300g離心10 min，取沉淀用PBS液充分混勻，平分3份提取人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞。

2.分離純化：(1)密度梯度離心法：5 ml沉淀用PBS配成懸液，以1∶1的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入到50%Percoll分離液上，以1 800 r/min離心20 min，用巴氏吸管小心吸取中間白色顆粒細(xì)胞層，用PBS洗滌1遍，重復(fù)上述步驟一次，留取沉淀待消化。(2)紅細(xì)胞裂解法：5 ml沉淀加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，37℃孵育5 min后離心，棄上清，若沉淀仍有紅色，可重復(fù)上述步驟一次。最后用PBS洗滌1遍，離心棄上清，留取沉淀待消化。(3)密度梯度離心法+紅細(xì)胞裂解法：5 ml沉淀用PBS配成懸液，以1∶1的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入到50%Percoll分離液上，離心，吸取中間白色顆粒細(xì)胞層，加入PBS洗滌1次，后按上述紅細(xì)胞裂解法進(jìn)行操作，留取沉淀待消化。(4)消化：將沉淀的黏液團(tuán)通過200目過濾網(wǎng)過濾，后加入胰酶，輕輕吹打混勻，室溫消化5～10 min以獲取單細(xì)胞懸液。然后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，用PBS洗滌1次，留取細(xì)胞沉淀待用。

3.細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率檢測：用含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素DMEM/F12培養(yǎng)液(與后文所提培養(yǎng)液一致)重懸細(xì)胞，吸取100 μl重懸的顆粒細(xì)胞到一塑料EP管內(nèi)，加入等體積臺盼藍(lán)染色液，輕輕混勻，染色5 min后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。存活率計(jì)算公式：活細(xì)胞率=(細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)染細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于96孔板，每孔200 μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，用于CCK8測細(xì)胞生長曲線。另取細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，接種到放置有蓋玻片的12孔板中培養(yǎng)，48 h后換液1次，培養(yǎng)72 h后用于顆粒細(xì)胞鑒定。

5.人卵泡顆粒細(xì)胞的鑒定：顆粒細(xì)胞是女性體內(nèi)唯一表達(dá)卵泡刺激素受體(FSHR)的細(xì)胞[7]，本研究采用以FSHR表達(dá)作為鑒定顆粒細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：(1)FSHR免疫組織化學(xué)染色：顆粒細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞爬片用PBS沖洗5 min×3次；4%多聚甲醛固定5 min，PBS沖洗5 min×3次；0.1%Triton通透化處理5 min，3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次；滴加正常山羊血清，孵育15 min，傾去；孵育一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200)，4℃過夜，PBS洗滌5 min；HRP標(biāo)記的二抗37°孵育45 min，PBS洗滌3 min×3次；用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染10 min，鹽酸酒精分色，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。(2)FSHR免疫組織熒光染色：細(xì)胞固定及通透化處理同免疫組織化學(xué)過程相同，通透化處理后用PBS洗滌5 min×3次；滴加適量山羊血清封閉，孵育15 min，傾去；一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200)孵育，4℃過夜，PBS洗滌5 min×3次；孵育熒光二抗(按1∶200稀釋)1 h，PBS洗滌5 min×3次；用DAPI染色液染核5 min，PBS洗滌5 min×3次；抗熒光淬滅封片劑封片，后于熒光顯微鏡下觀察。

6.細(xì)胞體外生長曲線：96孔板培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞分別在孵育后24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入20 μl CCK8溶液，繼續(xù)孵育1.5 h。置Rayto酶聯(lián)免疫檢測儀(Perkin Elmer公司，美國)上測定450 nm雙波長處吸光度值(OD值)，取3孔OD平均值；以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、OD值為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、3種分離方法所得顆粒細(xì)胞數(shù)及存活率

紅細(xì)胞裂解法獲得的顆粒細(xì)胞數(shù)為(8.3±3.0)×106/ml，顯著多于密度梯度離心+紅細(xì)胞裂解法的(3.3±2.2)×106/ml和密度梯度離心法的(2.1±1.6)×106/ml(P<0.05)，密度梯度離心+紅細(xì)胞裂解法得到的細(xì)胞數(shù)稍多于密度梯度離心法，但兩者比較無顯著性差異(P>0.05)。臺盼藍(lán)染色后，發(fā)現(xiàn)2次密度梯度離心法和密度梯度離心法+紅細(xì)胞裂解法獲得的細(xì)胞活率均>90%，而紅細(xì)胞裂解法獲得的細(xì)胞活率為80%～90%。

二、顆粒細(xì)胞形態(tài)特征及生長狀態(tài)

顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換液，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞呈多突形或梭形，部分黏成一團(tuán)，胞內(nèi)可見黑色顆粒，有部分未貼壁顆粒細(xì)胞和少量的紅細(xì)胞分散漂浮。密度梯度離心法的貼壁細(xì)胞伸出細(xì)長偽足，緊密相連，細(xì)胞核大，圓形，胞質(zhì)顆粒均勻豐富，生長旺盛，周邊圍繞著少量未貼壁的細(xì)胞(圖1A)。密度梯度離心法+紅細(xì)胞裂解法較密度梯度離心法獲得的細(xì)胞貼壁數(shù)目少，周邊圍繞的未貼壁細(xì)胞數(shù)目略多(圖1B)。紅細(xì)胞裂解法的細(xì)胞貼壁數(shù)目最少，體積細(xì)長，伸出偽足數(shù)目少，細(xì)胞多分散生長，周邊圍繞多數(shù)仍未貼壁的細(xì)胞(圖1C)。

三、顆粒細(xì)胞鑒定

以FSHR表達(dá)作為鑒定顆粒細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，免疫組織化學(xué)染色后，鏡下觀察到陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜和胞質(zhì)呈棕褐色著染，F(xiàn)SHR陰性對照組表現(xiàn)為胞膜和胞質(zhì)呈深藍(lán)色著染，鏡下可見FSHR陽性率均>90%(圖2)，說明3種不同分離方法獲取的顆粒細(xì)胞純度達(dá)到90%以上。此外，細(xì)胞免疫熒光染色方法均檢測到FSHR陽性表達(dá)，胞質(zhì)呈紅染，顆粒細(xì)胞陽性率均>90%(圖3)，說明3種方法分離提純的顆粒細(xì)胞純度也均達(dá)到90%以上。

A：密度梯度離心法；B：密度梯度離心法+紅細(xì)胞裂解法；C：紅細(xì)胞裂解法圖1 不同分離方法提取的原代顆粒細(xì)胞48 h后的生長狀態(tài)(×200)

A：密度梯度離心法；B：密度梯度離心法+紅細(xì)胞裂解法；C：紅細(xì)胞裂解法；D：FSHR陰性對照圖2 體外原代顆粒細(xì)胞FSHR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

A：密度梯度離心法；B：密度梯度離心法+紅細(xì)胞裂解法；C：紅細(xì)胞裂解法圖3 體外原代顆粒細(xì)胞FSHR免疫熒光染色(×200)

四、顆粒細(xì)胞體外生長曲線

3種方法分離提純得到的顆粒細(xì)胞，采用CCK8方法檢測并繪制生長曲線圖，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24 h后密度梯度離心法獲得的顆粒細(xì)胞貼壁量多于其他兩種方法，繼續(xù)培養(yǎng)有明顯的細(xì)胞增殖，且細(xì)胞存活量均高于其他兩種方法。而紅細(xì)胞裂解法獲得的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁量最少且無明顯細(xì)胞增殖(圖4)。

五、顆粒細(xì)胞傳代后的貼壁、生長狀態(tài)

在倒置顯微鏡下觀察，密度梯度離心法提取的顆粒細(xì)胞傳代前(圖5A)和傳代24 h后(圖5B)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，傳代后的細(xì)胞貼壁數(shù)目極少，體積小于傳代前的細(xì)胞形態(tài)，多數(shù)未見明顯細(xì)長偽足，伸展差，細(xì)胞分散生長，并未相互連接、抱團(tuán)，周邊圍繞多數(shù)未貼壁和凋亡的顆粒細(xì)胞。

圖4 不同分離方法的顆粒細(xì)胞生長曲線

A：傳代前；B：傳代后圖5 密度梯度離心法提取的原代顆粒細(xì)胞傳代前及傳代后24 h的生長狀態(tài)(×200)

討 論

人卵巢顆粒細(xì)胞作為卵巢的最大細(xì)胞群，與生殖內(nèi)分泌功能密切相關(guān)，對研究卵母細(xì)胞的成熟機(jī)制、女性生殖功能、卵巢腫瘤等具有重要的臨床研究意義[8-9]。因此，如何有效分離獲取體外人卵巢顆粒細(xì)胞是各種實(shí)驗(yàn)開展的基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道的人卵巢顆粒細(xì)胞分離提純的方法，主要有紅細(xì)胞裂解法和密度梯度離心法。有研究認(rèn)為紅細(xì)胞裂解法是分離提純的最佳選擇[10]，其獲取的顆粒細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)多于密度梯度離心法，且分泌功能無顯著差異。但國外研究以密度梯度離心法作為分離、提純原代顆粒細(xì)胞的主要選擇[11-13]。以往研究多偏重于比較不同方法獲取的細(xì)胞數(shù)量、活率及實(shí)驗(yàn)效率，很少側(cè)重于對細(xì)胞貼壁、生長及傳代后的影響。因此，本研究旨在比較并結(jié)合這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析，為原代顆粒細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)提供最佳的分離選擇方法。

收集的卵泡液中主要混雜紅細(xì)胞以及少量白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。紅細(xì)胞裂解法通過裂解紅細(xì)胞從而獲取純度相當(dāng)?shù)念w粒細(xì)胞；密度梯度離心法則根據(jù)不同細(xì)胞比重的差異，借助分離液和離心對細(xì)胞進(jìn)行分離純化，但有部分顆粒細(xì)胞與紅細(xì)胞黏連而沉于管底，故獲取的細(xì)胞數(shù)目少于裂解法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)3種方法中紅細(xì)胞裂解法提取的細(xì)胞數(shù)目最多，但活率最低；密度梯度離心法雖然獲取細(xì)胞數(shù)量最低，但活率高；紅細(xì)胞裂解法+密度梯度離心法的獲取效果處于這兩種方法之間，但其細(xì)胞量仍遠(yuǎn)低于紅細(xì)胞裂解法。卵巢顆粒細(xì)胞是附著于卵泡腔面的復(fù)層立方上皮細(xì)胞，貼壁能力弱，其貼壁數(shù)目決定著細(xì)胞未來生長數(shù)目。本研究采用密度梯度離心法提取的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后貼壁數(shù)目最多，生長狀態(tài)最佳，而紅細(xì)胞裂解法獲取的細(xì)胞數(shù)目最低，狀態(tài)最差；紅細(xì)胞裂解法+密度梯度離心法獲取的顆粒細(xì)胞生長狀態(tài)亦處于這兩者之間?；贔SHR在顆粒細(xì)胞的特有表達(dá)，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行顆粒細(xì)胞鑒定，3種方法提取的細(xì)胞純度均達(dá)到90%以上。本研究中3種分離方法的細(xì)胞貼壁狀態(tài)提示紅細(xì)胞裂解參與的次數(shù)越多，細(xì)胞的活性和貼壁狀態(tài)可能越差；且紅細(xì)胞裂解法獲取的顆粒細(xì)胞生長曲線呈逐漸下降趨勢，提示顆粒細(xì)胞數(shù)目在培養(yǎng)過程中逐漸減少，可能是紅細(xì)胞裂解液或紅細(xì)胞裂解碎片對細(xì)胞活性產(chǎn)生了負(fù)面作用，此結(jié)論與江歡等[14]人的研究結(jié)果相似。相比之下，密度梯度離心法獲取的顆粒細(xì)胞24 h后貼壁增殖，并在培養(yǎng)48 h后達(dá)到生長高峰，72 h后逐漸出現(xiàn)凋亡，這與顆粒細(xì)胞在人體內(nèi)的變化趨勢相一致，說明該方法對細(xì)胞生長影響較??；但也有研究認(rèn)為密度梯度離心后的細(xì)胞貼壁不佳，狀態(tài)稍差[3]，推測這可能是由于實(shí)驗(yàn)過程中選擇的離心率過大，造成細(xì)胞損傷從而影響細(xì)胞活率及貼壁生長狀態(tài)。此外，本研究對密度梯度離心法獲取的顆粒細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)和傳代前相比，傳代后的細(xì)胞貼壁數(shù)目少、種類單一且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。因此，從細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量考慮，傳代后的顆粒細(xì)胞并不適合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，傳代后的顆粒細(xì)胞是否保持原有的細(xì)胞功能特性，是否能滿足人原代顆粒細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)條件仍需進(jìn)一步研究。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最終的實(shí)驗(yàn)對象主要是貼壁的卵巢顆粒細(xì)胞，因此，從最終貼壁的細(xì)胞數(shù)目和生長狀態(tài)考慮，本研究認(rèn)為密度梯度離心法是分離純化顆粒細(xì)胞最佳的選擇方法，紅細(xì)胞裂解法+密度梯度離心法并沒有顯示更好的優(yōu)點(diǎn)。即使為了進(jìn)一步分離混雜的白細(xì)胞，以獲取更高純度的顆粒細(xì)胞，密度梯度離心法也是初步分離條件方法的基礎(chǔ)[15]。因此，本研究為進(jìn)行體外原代顆粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法的選擇，提供了可靠依據(jù)。