杜兆金，吳雅慧，王楠

(1.青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，青島 266000；2.威海市立醫(yī)院婦產(chǎn)科，威海 264200)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，流行病學(xué)研究表明，隨著飲食習(xí)慣改變和生活水平提高，世界范圍內(nèi)糖尿病發(fā)病率逐年增高，成為威脅人類健康的主要代謝類疾病[1]。患者血糖長期處于較高水平，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激損傷，影響細胞正常生長，繼而出現(xiàn)細胞病變或凋亡[2-3]。據(jù)報道，2型糖尿病可導(dǎo)致患者性腺功能下降，精子存活率低[4]，但其作用機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路與高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)，是多種并發(fā)癥發(fā)生過程中的重要因素[5]，然而Notch信號通路在小鼠精母細胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通過觀察高糖對小鼠精母細胞GC-2spd細胞生長、凋亡及Notch信號通路的影響，探究高糖誘導(dǎo)小鼠精母細胞凋亡的作用機制，為尋找改善糖尿病患者精子存活情況的治療方案提供思路。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)及試劑

1.細胞培養(yǎng)：小鼠精母細胞GC-2spd(貨號：CRL-2196TM)購自上海酶聯(lián)生物研究所。小鼠精母細胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入M16培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，加入鏈霉素和青霉素，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進行常規(guī)培養(yǎng)(5%CO2，37℃)，收集生長至對數(shù)期細胞。

2.主要試劑與儀器：M16培養(yǎng)液、胎牛血清、葡萄糖購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、蛋白提取試劑盒(P0033)、CKK-8試劑盒(C0037)、細胞周期檢測試劑盒(C1052)、AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1063)，均購自上海碧云天公司；AceQ qPCR SYBR Green Mix(Q121-02)購自南京vazyme生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037Q)、Trizol試劑購自日本Takara公司；兔源Notch1抗體、Jagged1抗體、Hes1抗體、cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體、cleaved-caspase9抗體、羊抗兔二抗，均購自美國Abcam公司；自動酶標儀(Elx800)、熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀(CytoFLEX)購自德國MICROM公司。

二、實驗方法

1.實驗分組：收集對數(shù)期小鼠精母細胞GC-2spd，加入胰蛋白酶(0.25%)對GC-2spd細胞進行消化，轉(zhuǎn)接于6孔細胞培養(yǎng)板(1×105個/孔)，待細胞生長至融合度約80%時，分別更換培養(yǎng)基，對細胞進行處理。實驗分為兩組：(1)對照組：培養(yǎng)液中加入終濃度為5 mmol/L葡萄糖；(2)高糖組：培養(yǎng)液中加入終濃度為30 mmol/L葡萄糖。在高糖誘導(dǎo)48 h后，收集各組GC-2spd細胞，進行后續(xù)實驗。每組設(shè)置6個重復(fù)。

2.CKK-8法檢測GC-2spd細胞生長情況：收集上述兩組GC-2spd細胞，轉(zhuǎn)接至96孔板(5 000個/孔)，加入相應(yīng)濃度葡萄糖的M16培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，收集細胞，按照試劑盒說明書進行操作，采用全自動酶標儀(Elx800)檢測各孔細胞在450 nm波長下光密度值(OD)。

3.流式細胞術(shù)檢測GC-2spd細胞周期和凋亡：收集兩組GC-2spd細胞，按照細胞周期檢測試劑盒和AnnexinV-FITC細胞凋亡雙染試劑盒說明書處理樣品，采用流式細胞儀檢測，借助CellQuest軟件獲取實驗數(shù)據(jù)，采用ModFit LT4.0軟件分析數(shù)據(jù)。

4.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測caspase3、caspase9、Notch1、Jagged1、Hes1基因表達：收集兩組GC-2spd細胞，采用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照AceQ qPCR SYBR Green Mix試劑盒說明書對caspase3、caspase9、Notch1、Jagged1和Hes1基因進行擴增，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。以GAPDH基因為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT對各目標基因表達情況進行分析。qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成，具體序列見表1。

表1 Notch1、Jagged1、Hes1、caspase3、caspase9和GAPDH的qRT-PCR引物序列

5. 蛋白印跡(WB)法檢測cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達：收集兩組GC-2spd細胞，加入1.2 ml蛋白裂解液，逐步提取GC-2spd細胞中總蛋白，采用試劑盒測定蛋白總量。經(jīng)SDS-凝膠電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上；采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；之后分別加入兔源一抗Notch1抗體、Jagged1抗體、Hes1抗體、cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體和cleaved-caspase9抗體(1∶500)4℃孵育過夜；采用1倍磷酸緩沖液沖洗后，分別加入羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法檢測PVDF膜上的目標蛋白信號，Tanon軟件拍攝圖像并分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、高糖對GC-2spd細胞生長的影響

與對照組比較，高糖組存活小鼠精母細胞GC-2spd數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，見圖1。

二、高糖對GC-2spd細胞周期的影響

與對照組比較，高糖組G0/G1期小鼠精母細胞GC-2spd比例顯著增高，G2/M期GC-2spd細胞比例顯著降低(P<0.05)；而S期小鼠精母細胞GC-2spd比例兩組間無顯著性差異(P>0.05)，見圖2。

圖1 高糖對GC-2spd細胞生長的影響

三、高糖對GC-2spd細胞凋亡的影響

與對照組比較，高糖組小鼠精母細胞GC-2spd的早期凋亡率、晚期凋亡率均顯著增高(P<0.05)，見圖3。

A：對照組GC-2spd細胞周期情況；B：高糖組GC-2spd細胞周期情況；C：流式細胞術(shù)檢測GC-2spd細胞周期變化：與對照組比較，*P<0.05圖2 流式細胞術(shù)檢測高糖對GC-2spd細胞周期的影響

A：對照組GC-2spd細胞凋亡情況；B：高糖組GC-2spd細胞凋亡情況；C：流式細胞術(shù)檢測GC-2spd細胞凋亡的變化：與對照組比較，*P<0.05圖3 流式細胞術(shù)檢測GC-2spd細胞凋亡情況

四、高糖對GC-2spd細胞中caspase凋亡蛋白表達的影響

與對照組比較，高糖組小鼠精母細胞GC-2spd中caspase3和caspase9 mRNA及活性蛋白相對表達量均顯著增高(P<0.05)，見圖4。

五、高糖對GC-2spd細胞Notch通路相關(guān)基因表達的影響

與對照組比較，高糖組小鼠精母細胞GC-2spd中Notch、Jagged1、Hes1 mRNA及蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

A：qRT-PCR檢測GC-2spd細胞中caspase mRNA相對表達量；B：WB法檢測GC-2spd細胞中caspase凋亡蛋白表達情況。與對照組比較，*P<0.05圖4 高糖對GC-2spd細胞中caspase凋亡蛋白表達的影響

A：qRT-PCR檢測GC-2spd細胞中Notch通路mRNA相對表達量；B：WB法檢測GC-2spd細胞中Notch通路蛋白表達情況。與對照組比較，*P<0.05圖5 高糖對GC-2spd細胞中Notch通路蛋白表達的影響

討 論

精子發(fā)生過程起始于精原細胞，先經(jīng)過有絲分裂增殖分化為初級精母細胞，后經(jīng)過減數(shù)分裂最終分化為成熟精子[6]。初級精母細胞的凋亡對淘汰缺陷精子、維持成熟精子數(shù)量非常重要，其異常凋亡會導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，影響生育能力，因此精母細胞存活情況和健康程度是決定精子質(zhì)量的關(guān)鍵[7-8]。本研究采用終濃度為30 mmol/L葡萄糖的M16培養(yǎng)液模擬體內(nèi)高糖環(huán)境，觀察高糖對小鼠精母細胞GC-2spd增殖和細胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖作用24 h后，同一時間點高糖組小鼠精母細胞GC-2spd的OD值均顯著降低(P<0.05)，表明高糖作用后小鼠精母細胞GC-2spd生長速度顯著減慢，提示高糖可抑制GC-2spd細胞生長。且高糖組G0/G1期GC-2spd細胞比例顯著增高，G2/M期細胞比例顯著降低(P<0.05)，提示高糖可誘導(dǎo)GC-2spd細胞停滯在G0/G1期，阻止其進入G2/M期，抑制細胞增殖。表明高糖可阻滯細胞周期，使其失去分裂能力，影響細胞生長，但其具體機制尚不清楚。另有研究表明G0/G1期細胞增多與細胞凋亡密切相關(guān)[9-10]，因此本研究進一步對高糖對GC-2spd細胞凋亡的影響進行研究。

精子存活率低與精母細胞異常凋亡密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖作用后，GC-2spd細胞早、晚期凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)，表明高糖環(huán)境可促進GC-2spd細胞凋亡。細胞凋亡是機體自主調(diào)控的一種死亡過程，涉及一系列凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)[11]。其中依賴caspase凋亡通路是主要的凋亡通路，一般情況下，細胞凋亡的執(zhí)行者caspase3以前體的形式存在[12]；當細胞接觸到凋亡信號或刺激后，經(jīng)過一系列的信號傳導(dǎo)，引起caspase9大量表達，誘導(dǎo)Procaspase3裂解活化，啟動細胞凋亡程序[13]。本研究中，高糖作用48 h后，caspase3、caspase9在小鼠精母細胞GC-2spd中mRNA及活性蛋白相對表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，提示高糖處理可誘導(dǎo)小鼠精母細胞caspase3凋亡通路活化，啟動凋亡，但其機制尚不明確。

Notch信號通路的激活依賴于Notch基因編碼的跨膜受體與其鄰近細胞表面的配體相互結(jié)合，進而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等生理生化過程[14]。目前已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)4種Notch基因編碼的跨膜受體，分別為Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4以及dll1、dll3、dll4、Jagged1、Jagged2五種配體[15]。Yoon等[16]采用體外實驗?zāi)M高糖對血管生成過程的影響，發(fā)現(xiàn)高糖條件下，血管出現(xiàn)直徑減小、生長和分支增加、不穩(wěn)定性增加等，認為高糖可能抑制Notch1和Jagged1蛋白表達，導(dǎo)致異常血管生成。Zhang等[17]采用高糖處理H9c2細胞建立糖尿病心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)高糖可抑制Notch1蛋白在H9c2細胞中表達，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，且Notch1過表達可抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。Allam等[18]研究發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌細胞中糖基化可通過促進Notch受體的活化狀態(tài)，促進腫瘤細胞增殖和遷移，抑制Notch蛋白活化可促進腫瘤細胞凋亡，提示抑制糖基化水平可通過抑制Notch活化抑制卵巢癌細胞增殖，促進其凋亡。Wei等[19]研究報道，Notch1、Hes1等蛋白在高糖誘導(dǎo)的心肌細胞中低表達，松弛素可通過調(diào)節(jié)Notch通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，增加其生存能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖組GC-2spd細胞中Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA和蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，表明高糖可抑制Notch信號通路活化，與Zhang等[17]在H9c2細胞中的發(fā)現(xiàn)一致。另有研究表明，Notch通路相關(guān)基因的異常激活可抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，與糖尿病所致心肌梗死等多種疾病的發(fā)生相關(guān)[20]，提示抑制Notch通路激活可能抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。但高糖如何抑制Notch信號通路活化及該通路如何影響細胞增殖和凋亡的具體機制尚未闡明，有待進一步研究探討。

綜上所述，高糖可能通過抑制Notch信號通路活化抑制GC-2spd細胞增殖，促進其凋亡，提示Notch信號通路可能作為潛在靶標應(yīng)用于糖尿病所致精子存活率低的臨床治療。