陳琳 郭華 孫亞麗 徐瑞

1 陜西省人民醫(yī)院病理科（西安710068）；2陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科一病區(qū)（西安710061）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中約80%為非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC），手術(shù)切除是治療NSCLC的首選方法，但一部分患者確診時已錯過了最佳的手術(shù)時機，多數(shù)接受了手術(shù)的患者仍需要輔助放化療，而傳統(tǒng)的放化療對晚期NSCLC 患者療效十分有限。研究證實，胸膜侵犯、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等都是影響手術(shù)切除NSCLC 預(yù)后的因素。近年來，隨著對分子靶向治療的深入研究，以表皮生長因子受體絡(luò)氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）和間變性淋巴瘤激酶抑制劑（ALK-TKI）為代表的分子靶向治療可顯著延長患者的總生存期，由于其見效快、副作用小，目前已被批準(zhǔn)用于EGFR/ALK 基因檢測陽性晚期NSCLC 患者的一線治療。本研究回顧性分析陜西省人民醫(yī)院2015年6月至2017年11月經(jīng)手術(shù)治療的NSCLC 患者216 例EGFR 基因突變狀態(tài)及EML4-ALK 融合基因檢測情況，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，探討NSCLC 患者EGFR 基因及EML4-ALK 融合基因突變的意義，以期指導(dǎo)臨床診斷及治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集陜西省人民醫(yī)院2015年6月至2017年11月收治并病理確診的NSCLC 患者216 例為研究對象，均經(jīng)手術(shù)切除，術(shù)前未經(jīng)任何化療、放療及生物免疫治療，收集臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜侵犯情況等。其中男133 例，女83 例；年齡30 ～88 歲，中位年齡62 歲，其中年齡＜60 歲的82 例，年齡≥60 歲的134 例；腺癌173例（低分化84 例，中分化65 例，高分化24 例），鱗癌37 例（低分化13 例，中分化22 例，高分化2 例），其他6 例（包括大細(xì)胞癌1 例、腺樣囊性癌1 例、腺鱗癌4 例）；吸煙者120 例，不吸煙者96 例；伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者47 例，區(qū)域淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者169 例；胸膜侵犯者65 例，無胸膜侵犯者151 例。216 例病例中，所有病例均進行了EGFR 基因檢測，突變率為40.7%，其中有99 例病例同時進行了EML4-ALK融合基因檢測，6 例存在EML4-ALK 融合基因突變，突變率為6.1%。

1.2 樣本準(zhǔn)備 手術(shù)切除樣本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚4 μm，HE 染色，光鏡觀察，所有樣本均經(jīng)兩位及以上高年資病理醫(yī)師復(fù)診，病理質(zhì)控確認(rèn)樣本中腫瘤含量超過80%后，每例標(biāo)本連續(xù)切10 張（每張10 μm）白片，不漂洗脫蠟，直接封存于1.5 mL EP 管中備用。

1.3 基因檢測方法 采用EGFR 基因突變定性試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）和ALK融合基因定性檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司），進行EGFR 基因和ALK 基因檢測。檢測按照試劑盒說明書，腫瘤組織石蠟切片采用過柱法提取DNA 和RNA，通過擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS-PCR 法）對樣本DNA 中EGFR 基因突變進行檢測，RT-PCR 方法對樣本RNA 中ALK 基因融合進行檢測。從而觀察及分析NSCLC 組織中EGFR 基因突變及EML4-ALK 融合基因表達(dá)狀況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法對EGFR 基因突變和EML4-ALK融合基因表達(dá)狀況及相關(guān)臨床病理信息進行分析，多因素分析采用Logistic 回歸模型進行多變量分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 基因檢測狀況 216 例NSCLC 患者中，EGFR突變率為40.7%（88/216），其中19del和21L858R是主要的突變類型，其突變率分別為20.4%和15.7%；其他突變類型少見，總的突變率僅為4.6%，包括21L861Q、18G719X、20S768I、20T790M和20ins?？傮w來說，敏感突變的突變率為38.0%，包括19del、21L858R、18G719X、20S768I 和21L861Q；原發(fā)耐藥突變的突變率為1.4%，包括20T790M 和20ins。所有患者中，具有EGFR 雙突變的患者共3 例，分別為2 例19-del/21L858R 雙突變以及1 例18G719X/20S768I 雙突變。見表1。

表1 NSCLC 患者EGFR 基因突變情況Tab.1 Mutation of EGFR gene in NSCLC patients

2.2 NSCLC 患者EGFR 基因突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系 本研究分析了216 例NSCLC 患者年齡、性別、吸煙史、病理類型、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及胸膜侵犯情況與EGFR 基因突變狀態(tài)間的關(guān)系（表2）。結(jié)果表明，女性患者EGFR 突變率明顯高于男性（P=0.001）；不吸煙人群突變率明顯高于吸煙人群（P＜0.001）；腺癌患者EGFR 突變率明顯高于非腺癌患者（P＜0.001）；有胸膜轉(zhuǎn)移者更易檢測到EGFR 突變（P=0.004）。而在關(guān)于年齡、分化程度以及是否有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分析中，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。為了排除混雜因素，筆者將性別、吸煙史、病理類型以及胸膜轉(zhuǎn)移情況納入Logistic 多因素回歸分析，結(jié)果顯示，吸煙史和病理類型是EGFR 突變的獨立影響因素，即EGFR 基因突變更易發(fā)生于無吸煙史及腺癌患者（表3）。

表2 EGFR 突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between EGFR mutation and clinicopathological features例

表3 EGFR 突變狀態(tài)與臨床病理特征關(guān)系的Logistic 多因素回歸分析Tab.3 Logistic multivariate regression analysis of the relationship between EGFR mutation and clinicopathological features

2.3 NSCLC 患者EML4-ALK 融合基因表達(dá)狀況與臨床病理特征的關(guān)系 99 例NSCLC 患者進行了EML4-ALK融合基因突變檢測，其中6例存在EML4-ALK 融合基因突變，其突變率遠(yuǎn)低于EGFR 基因突變率（χ2=38.998，P＜0.001）。EML4-ALK融合基因突變率年齡＜60 歲的患者突變率高于年齡≥60 歲者；女性突變率高于男性；無吸煙史者高于有吸煙史者；腺癌患者高于非腺癌患者；低分化者高于中、高分化者，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。另外，本研究對EGFR 陰性的患者EML4-ALK 融合基因突變情況進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在EGFR 陰性患者中，ALK的突變率提高到10.0%。在99 例同時檢測了EGFR 基因突變和EML4-ALK 融合基因表達(dá)的NSCLC病例中，未發(fā)現(xiàn)EGFR 基因與EML4-ALK 融合基因共突變的患者。見表4。

表4 ALK 突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.4 The relationship between ALK mutation and clinicopathological features 例

3 討論

早期NSCLC 根治性手術(shù)是最有效的治療手段，但一部分患者確診時已錯過了最佳的手術(shù)時機，尤其是當(dāng)出現(xiàn)胸膜侵犯或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，即失去根治性手術(shù)治愈的機會。對這部分患者，臨床多輔以放、化療，而傳統(tǒng)的放化療對晚期NSCLC 患者療效十分有限。近年來，分子靶向治療因其特異性高、不良反應(yīng)輕，從而開啟了肺癌治療的新時代。對各類靶向分子突變患者相關(guān)臨床病理特點的研究有助于篩查出更多靶向治療受益患者。目前，EGFR 基因突變和EML4-ALK 基因重排是NSCLC 最重要的兩個驅(qū)動基因，也是NSCLC 進行分子靶向治療必要的預(yù)測指標(biāo)。

EGFR 屬于表皮生長因子受體家族，是一種具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白跨膜受體，是原癌基因Her-1 的表達(dá)產(chǎn)物，位于7 號染色體短臂的12-14區(qū)，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究［1］表明，NSCLC 患者中EGFR 基因突變可持續(xù)活化EGFR 酪氨酸激酶，促進腫瘤的增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。針對EGFR 突變而設(shè)計的特定靶向藥物EGFR-TKI 是最先被成功開發(fā)為抗腫瘤靶向治療的藥物之一，其中吉非替尼（gefitinib）、厄洛替尼（erlotinib）、?？颂婺幔╥cotinib）等TKI 藥物可以通過對腫瘤細(xì)胞EGFR 的特異性結(jié)合阻斷細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進其凋亡的目的，已被廣泛應(yīng)用于臨床。

EGFR 突變狀態(tài)與EGFR-TKI 治療療效密切相關(guān)，不同EGFR 突變類型對EGFR-TKI 的反應(yīng)率也不盡相同。研究表明，19del 突變患者接受EGFRTKI 的療效優(yōu)于L858R 突變患者；20ins 和T790M突變與EGFR-TKI 原發(fā)及繼發(fā)耐藥有關(guān)；而L861Q、G719X、S768I 等其他突變類型患者對EGFR-TKI 的反應(yīng)性低于19del 和L858R 突變患者，突變率較低，且常常傾向于以聯(lián)合突變的形式存在［2］。因此，深入分析EGFR 突變狀態(tài)及突變類型與EGFR-TKI治療療效密切相關(guān)。臨床最常見的突變類型包括19 外顯子缺失突變及21 外顯子L858R 突變，約占總突變類型的80% ～90%［3］。本研究中，19del 和21L858R 是NSCLC EGFR 最主要的突變類型，本組這兩類經(jīng)典突變約占所有EGFR 突變的88.6%（78/88），與以往的研究結(jié)果相一致。耐藥基因20ins 和T790M 的突變率分別為0.9%和0.5%。其他突變類型，包括21L861Q、18G719X、20S768I，總的突變率為1.9%。EGFR 雙突變患者對EGFR-TKI反應(yīng)率較19del 和L858R 單突變患者反應(yīng)率低［4］，因此要特別關(guān)注，本組有3 例患者存在雙突變，分別為2 例19-del/21L858R 雙突變以及1 例18G719X/20S768I 雙突變。

據(jù)報道，EGFR 在NSCLC 中的基因突變率與人種有關(guān)，西方人群EGFR基因突變率為10%～20%，東亞人群EGFR 基因突變率為30% ～50%［5-6］，本研究中，EGFR 基因突變率為40.7%，符合文獻(xiàn)報道。以往的研究表明，EGFR 突變更易發(fā)生于女性、無吸煙史和腺癌人群中，但區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯以及腫瘤分化程度等與EGFR 突變之間的關(guān)系尚存在爭議［7］。本研究中，NSCLC患者EGFR基因突變率以女性、不吸煙者、腺癌患者較高，NSCLC 胸膜侵犯者EGFR 突變率高達(dá)53.8%，高于無胸膜侵犯者的34.4%，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；NSCLC 區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者EGFR 突變率為46.8%，但與無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的39.1%相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而年齡、分化程度未發(fā)現(xiàn)與EGFR 基因突變相關(guān)。為了消除混雜因素的影響，提高結(jié)論的可靠性，本研究在單因素分析基礎(chǔ)上利用多因素Logistic 多元回歸分析，篩選出吸煙史和病理類型是EGFR 突變的獨立影響因素，即EGFR基因突變更易發(fā)生于不吸煙人群及腺癌患者。

ALK 是胰島素受體超家族中的一員，由染色體2p23 編碼，正常情況下在神經(jīng)系統(tǒng)有表達(dá)，該基因異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞凋亡的下調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。EML4 是棘皮動物微管相關(guān)樣蛋白家族中的一員，位于2 號染色體的p21基因片段。2007年日本學(xué)者SODA首次證實EML4-ALK 融合基因為NSCLC 的驅(qū)動基因，EML4-ALK融合基因由第2 號染色體短臂插入引起（包括2p21 和2p23），由ALK 基因的3，端與EML4 基因的5，端倒位融合形成，形成ALK 同源或異二聚體，引起構(gòu)象變化，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化，活化多個細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與調(diào)解腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)［8］。所有ALK 基因融合都發(fā)生在20 號外顯子編碼的一段序列，而EML4 斷裂點則表現(xiàn)出多變性，目前為止，已在不同腫瘤中發(fā)現(xiàn)了11 種EML4-ALK 融合基因型。不同EML4-ALK融合基因變體酪氨酸激酶活性程度有明顯差異，但均具有惡性轉(zhuǎn)化和致瘤能力。隨后以其為有效靶點的ALK 酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼（crizotinib）等靶向藥物被批準(zhǔn)用于EML1-ALK 融合基因陽性的NSCLC 治療，并取得了一定療效。

EML4-ALK 融合基因在NSCLC 中的陽性率是否存在種族和地域差異目前尚無定論，西方國家高加索人的表達(dá)陽性率為0.4% ～2.7%，亞裔人群NSCLC 患者陽性率為4.1%～5%，我國的陽性率為4.6%～12.04%［9-10］。有學(xué)者認(rèn)為，亞裔人群EML4-ALK 基因融合發(fā)生率略高于高加索人群。本研究中，99 例NSCLC 患者EML4-ALK 融合基因陽性表達(dá)率為6.1%，與文獻(xiàn)報道結(jié)果大致相符。目前，EML4-ALK 融合基因在NSCLC 中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系目前尚無定論。WANG 等［11］通過對4 511 例NSCLC 患者的EML4-ALK 融合基因檢測結(jié)果進行Meta 分析后得出，EML4-ALK 融合基因陽性多發(fā)生于女性、無吸煙史、腺癌患者。也有文獻(xiàn)報道EML4-ALK 融合基因陽性的患者通常為年輕、男性、無吸煙史、腺癌患者［12］。本組研究中，年齡＜60 歲、女性、無吸煙史、腺癌患者EML4-ALK融合基因突變率高于年齡≥60 歲、男性、不吸煙人群、非腺癌患者，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。究其原因可能與本研究標(biāo)本量不夠大，以及EML4-ALK 融合基因陽性樣本量偏少有關(guān)。

EGFR 基因突變和EML4-ALK 融合基因重排在多數(shù)情況下被認(rèn)為是獨立的分子事件，相互排斥。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在無吸煙史并且EGFR 未檢測到突變的NSCLC 患者，EML4-ALK 融合基因檢出率高達(dá)33%；其中34 個EGFR-TKI 耐藥者有29%檢出了EML4-ALK 融合基因［13］。亦有研究［14］表明厄洛替尼不能抑制EML4-ALK 陽性的NSCLC 細(xì)胞株H3122 增殖，于是推測EML4-ALK 融合基因可能是EGFR-TKI 原發(fā)耐藥的分子因素之一。然而近年來陸續(xù)有二者共存的病例報道，說明ALK 與EGFR基因突變并不是絕對彼此之間互相排斥，個別患者可能會有ALK 與EGFR 雙基因突變的產(chǎn)生［15］。本研究同時對99 例NSCLC 病例進行EGFR 基因突變與EML4-ALK 融合基因檢測，未發(fā)現(xiàn)ALK 和EGFR 雙突變的病例。