劉方 曹璐 許聰 向國敏 牛昀

人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽性乳腺癌具有惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差等特點(diǎn)，盡管針對HER-2的靶向治療已很大程度上改善了患者預(yù)后，但仍有部分患者會發(fā)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。因此，針對HER-2陽性乳腺癌患者尋求新的治療策略至關(guān)重要。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）是指被募集至腫瘤病灶區(qū)域內(nèi)的淋巴細(xì)胞群，在腫瘤免疫機(jī)制中發(fā)揮免疫應(yīng)答和調(diào)控作用。研究顯示，TILs 對HER-2 陽性乳腺癌患者具有潛在的治療效果評估和預(yù)測預(yù)后價(jià)值［1］。雄激素受體（androgen receptor，AR）在乳腺癌中的表達(dá)率高達(dá)70%～90%，HER-2 陽性乳腺癌患者的AR 高表達(dá)預(yù)示預(yù)后較差［2］。HER-2 和AR 共表達(dá)的乳腺癌患者同時行HER-2 和AR 靶向治療，具有協(xié)同抗癌效果［3］。在前列腺癌中TILs浸潤水平與AR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［4］，三陰性乳腺癌中腫瘤低免疫反應(yīng)與AR 表達(dá)相關(guān)［5］，但HER-2陽性乳腺癌中TILs與AR之間的關(guān)系少見報(bào)道。本研究旨在通過對HER-2陽性乳腺癌患者的大樣本臨床資料進(jìn)行分析，探討TILs 浸潤水平和AR表達(dá)的關(guān)系，為HER-2陽性乳腺癌患者特別是耐藥患者提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2018年3月至2018年11月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的448例HER-2陽性乳腺癌患者的臨床資料?；颊吣挲g為27～77歲，中位年齡為52歲。雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性率為55.8%（250/448）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性率為43.3%（194/448）。在乳腺癌組織學(xué)分級中，Ⅱ級患者為51.3%（230/448）、Ⅱ～Ⅲ級為25.9%（116/448）、Ⅲ級為22.8%（102/448）。P53陽性率為48.0%（215/448），Ki-67指數(shù)較高的患者為97.1%（435/448），有脈管癌栓的患者為41.5%（186/448），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為39.3%（176/448）。入組標(biāo)準(zhǔn)：1）免疫組織化學(xué)法檢測HER-2（+++）或熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）檢測HER-2陽性的乳腺癌患者；2）病理學(xué)類型為非特殊型浸潤性導(dǎo)管癌；3）女性原發(fā)單側(cè)乳腺癌；4）臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）HER-2陰性患者；2）其他類型乳腺癌；3）男性乳腺癌；4）原發(fā)性雙乳腺癌；5）臨床病理資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 病理評估 TILs分為腫瘤內(nèi)和間質(zhì)內(nèi)TILs，腫瘤內(nèi)TILs在癌巢中直接與腫瘤細(xì)胞接觸，且細(xì)胞之間無間質(zhì)組織，間質(zhì)內(nèi)TILs分布在腫瘤細(xì)胞之間的間質(zhì)內(nèi)，且不與腫瘤細(xì)胞接觸。間質(zhì)內(nèi)TILs浸潤更具有臨床意義，且其評價(jià)結(jié)果具有可重復(fù)性，因此本研究主要評估間質(zhì)內(nèi)TILs 的浸潤情況。采用蘇木素-伊紅（haematoxylin&eosin，H&E）染色方法對448例HER-2陽性乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下評估TILs浸潤水平。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片處理，EDTA緩沖液抗原修復(fù)，常規(guī)免疫組織化學(xué)SP 法檢測AR 表達(dá)。SP-9000、DAB試劑盒以及兔抗人AR單抗（1∶200稀釋）均購自北京中杉生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明封固。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn) TILs的判定標(biāo)準(zhǔn)為：TILs的浸潤水平＜10%為無浸潤或低浸潤，10%～39%為中等浸潤，浸潤水平≥40%為高浸潤［6］。AR的判定標(biāo)準(zhǔn)為：腫瘤細(xì)胞核著色＞10%定義為AR 陽性［7］。ER、PR 的判定標(biāo)準(zhǔn)為：腫瘤細(xì)胞核著色≥1%定義為ER、PR 陽性。HER-2 的判定標(biāo)準(zhǔn)為：免疫組織化學(xué)法檢測HER-2無染色或（+）判定為陰性，（+++）判定為陽性，（++）采用FISH 進(jìn)行驗(yàn)證，F(xiàn)ISH 結(jié)果陽性判定為陽性，反之則判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TILs浸潤水平和AR表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

448 例HER-2 陽性乳腺癌患者中，TILs 無浸潤或低浸潤的患者占38.2%（171/448）、中等浸潤者占42.2%（189/448）、高浸潤者占19.6%（88/448），AR 陽性率為62.7%（281/448）。TILs 浸潤水平與乳腺癌組織學(xué)分級、ER和PR表達(dá)以及是否有脈管癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（均P＜0.05），AR 表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級以及ER和PR表達(dá)密切相關(guān)（均P＜0.05），TILs浸潤水平與AR表達(dá)密切相關(guān)（P=0.001，表1）。

表1 448例HER-2陽性乳腺癌患者的TILs浸潤水平和AR表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

表1 448例HER-2陽性乳腺癌患者的TILs浸潤水平和AR表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系（續(xù)表1）

2.2 TILs浸潤水平與AR表達(dá)的相關(guān)性分析

對TILs 浸潤水平與AR 表達(dá)的關(guān)系采用Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TILs 浸潤水平與AR 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（表2）。TILs 的不同浸潤水平見圖1，乳腺癌中TILs的不同浸潤水平與AR表達(dá)情況見圖2。

2.3 ER不同狀態(tài)下TILs浸潤水平和AR表達(dá)的關(guān)系

TILs浸潤水平和AR表達(dá)均與ER狀態(tài)密切相關(guān)（P＜0.05），進(jìn)一步分析ER不同狀態(tài)時TILs浸潤水平和AR表達(dá)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在ER陽性乳腺癌中TILs浸潤水平和AR表達(dá)密切相關(guān)（P=0.009），而在ER陰性乳腺癌中TILs浸潤水平和AR表達(dá)未見明顯相關(guān)（P=0.237，表3）。

表2 448 例HER-2 陽性乳腺癌患者的TILs 浸潤水平與AR 表達(dá)的相關(guān)性分析

圖1 HER-2陽性乳腺癌中不同TILs浸潤水平的表達(dá)情況（H&E×200）

圖2 乳腺癌中TILs 的不同浸潤水平與AR 表達(dá)情況（SP×200）

表3 448例HER-2陽性乳腺癌患者的ER不同狀態(tài)下TILs浸潤水平和AR表達(dá)的關(guān)系

3 討論

TILs主要包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等不同類型，其中主要發(fā)揮抗腫瘤作用的T淋巴細(xì)胞又分為CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等。TILs的類型和浸潤水平與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)［8-9］。在HER-2陽性乳腺癌中，高TILs浸潤水平的患者常常預(yù)后較好［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，在HER-2陽性乳腺癌中TILs浸潤水平在不同的組織學(xué)分級中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Raphael等［11］報(bào)道，在HER-2陽性乳腺癌中，TILs浸潤水平與組織學(xué)分級呈正相關(guān)，即組織學(xué)分級越高，TILs浸潤水平越高。提示TILs浸潤水平與腫瘤分化程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TILs浸潤水平與脈管癌栓以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Caziuc等［12］研究亦發(fā)現(xiàn)，無論是在早期還是局部晚期乳腺癌中，高TILs浸潤水平的患者均較少發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示TILs的浸潤水平可作為腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。有研究指出，TILs浸潤水平影響HER-2陽性乳腺癌患者對新輔助化療和曲妥珠單抗治療的反應(yīng)性［13］。因此，研究乳腺癌中影響TILs的相關(guān)因素并進(jìn)行干預(yù)，可能有助于提高患者的抗腫瘤免疫機(jī)能，提高臨床腫瘤治療效果，改善患者預(yù)后。

Ylitalo 等［4］報(bào)道，去勢抵抗性前列腺癌患者的TILs浸潤水平和AR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，在三陰性乳腺癌中，腫瘤的低免疫反應(yīng)與AR 的表達(dá)相關(guān)［5］。本研究通過大樣本臨床病例資料分析發(fā)現(xiàn)，在HER-2陽性乳腺癌中，TILs的浸潤水平與AR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在TILs 高浸潤的患者中AR 低表達(dá)，而在TILs 低浸潤的患者中AR 高表達(dá)。Ylitalo 等［4］還發(fā)現(xiàn)，AR 表達(dá)與癌細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類抗原呈負(fù)相關(guān)。MHC-Ⅰ類抗原高表達(dá)的癌細(xì)胞更易被免疫細(xì)胞識別，激活機(jī)體對癌細(xì)胞的免疫殺傷作用，從而募集更多的淋巴細(xì)胞到癌巢中。提示AR 可能通過調(diào)控MHC-Ⅰ類抗原的表達(dá)影響腫瘤中TILs 的浸潤水平。HER-2陽性乳腺癌中TILs與AR的相關(guān)性，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供了科學(xué)依據(jù)，可對AR高表達(dá)的HER-2 陽性乳腺癌同時行AR 靶向治療，而對于AR低表達(dá)的HER-2陽性患者行聯(lián)合免疫治療。

在乳腺癌中，AR 的功能取決于ER 的狀態(tài)。在ER和AR同時陽性乳腺癌中，AR通過阻斷ER介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，從而抑制癌細(xì)胞生長；在ER陰性而AR陽性乳腺癌中，AR通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長［14］。此外，有研究顯示，TILs 在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值取決于ER或HER-2的狀態(tài)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，僅在ER 陽性乳腺癌患者中，TILs 和AR 才具有相關(guān)性，而在ER陰性乳腺癌患者中無相關(guān)性，提示ER或許參與TILs和AR的關(guān)系調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究初步分析了HER-2 陽性乳腺癌患者的TILs浸潤水平和AR表達(dá)的關(guān)系，為臨床治療方案的選擇提供重要的依據(jù)。深入研究不同類型TILs與AR表達(dá)的關(guān)系及其之間的相互作用，可能為乳腺癌精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。