周亞琴，李夢云，夏效東*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）周身鞭毛，為革蘭氏陰性菌，其無芽孢，多寄生于腸道內(nèi)[1]。作為食源性條件致病菌，阪崎克羅諾腸桿菌可致使嬰幼兒以及免疫力低下者感染腦膜炎、小腸結(jié)腸炎等疾病，致死率極高，達(dá)50%～80%[2-4]。盡管臨床上已用一些抗生素治療這些疾病，但部分康復(fù)的患者仍舊會伴有嚴(yán)重的后遺癥例如發(fā)育障礙等[5]。該菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求量不大，對環(huán)境的耐受能力卻極強(qiáng)，眾多研究結(jié)果表明，致病菌能否感染宿主取決于其對外界環(huán)境的感知和應(yīng)對能力。2000—2016年期間，阪崎克羅諾腸桿菌對于我國嬰幼兒食品的污染現(xiàn)象并不罕見，檢出率高達(dá)21.62%，可見對于克羅諾腸桿菌的控制遠(yuǎn)不能達(dá)到實際生產(chǎn)要求[6]。

阪崎克羅諾腸桿菌存在于自然界各處[7-8]，已有研究表明，能夠從糞便、谷作物、食材、水、泥土等處分離出阪崎克羅諾腸桿菌。雖然迄今為止，對于阪崎克羅諾腸桿菌的傳播方式以及宿主仍舊不明，但是由其引發(fā)的疾病已證實只與嬰幼兒配方奶粉有關(guān)，所以嬰幼兒配方奶粉被認(rèn)定為是阪崎克羅諾腸桿菌感染嬰幼兒人群的主要傳播媒介[5,9]。從最初污染嬰幼兒奶粉一直到進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)引發(fā)疾病，阪崎克羅諾腸桿菌需要克服多種環(huán)境壓力才能夠存活以引發(fā)人體疾病，例如溫度、酸度、滲透壓等，已有研究表明阪崎克羅諾腸桿菌能夠存活于多種極端環(huán)境，對滲透壓和溫度具有強(qiáng)耐受力[10]。

PhoP是一種胞內(nèi)效應(yīng)蛋白，與胞外感應(yīng)蛋白PhoQ組成PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)，該調(diào)控系統(tǒng)普遍存在于腸道桿菌之中，在腸道桿菌應(yīng)對宿主環(huán)境的過程中起著至關(guān)重要的作用，能夠調(diào)節(jié)毒力，調(diào)節(jié)多種革蘭氏陰性菌的活性。位于細(xì)菌外膜上的PhoQ蛋白感應(yīng)外界環(huán)境后，將磷酸基團(tuán)傳至PhoP蛋白從而將其激活，被激活的PhoP蛋白作為調(diào)節(jié)子直接或間接調(diào)控一系列靶基因。phoP基因的缺失會導(dǎo)致PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)的轉(zhuǎn)磷酸化過程的失衡，使得致病菌的毒力降低。PhoP蛋白最早發(fā)現(xiàn)于鼠傷寒沙門氏菌中，具有調(diào)控非特異性酸性磷酸酶表達(dá)的功能，其中包含的字母pho有表示參與磷酸的代謝調(diào)節(jié)的含義[11]。Perez等[12]通過破壞結(jié)核分歧桿菌中的phoP基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明，phoP基因是結(jié)核分歧桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活生長的必要條件。

傳統(tǒng)的基因敲除方法是借助RecA重組系統(tǒng)，通過分子質(zhì)量大的復(fù)合體RecBCD使得DNA鏈解開，再通過RecA單鏈結(jié)合蛋白促進(jìn)各DNA片段進(jìn)行配對連接。然而，該方法有許多的不足之處。首先，該方法需要的靶基因同源臂較長，其次復(fù)合體RecBCD能夠降解線性DNA故而需要構(gòu)建具有特定靶位點的靶質(zhì)粒，最后，依照該傳統(tǒng)方法制備基因缺失菌株的成功率低，耗時費(fèi)力[13-14]。Red同源重組技術(shù)不同于RecA重組系統(tǒng)，不需要酶切等操作步驟，其原理是將攜有與靶基因兩端（50 bp左右）序列同源的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸片段，經(jīng)由電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入宿主體內(nèi)，在重組酶的作用下，與基因組的特定靶序列進(jìn)行高效重組替換，從而使得目的基因被敲除[15]。Red同源重組技術(shù)已成功運(yùn)用于多種細(xì)菌基因缺失菌株的構(gòu)建。

越來越多的研究表明，致病菌對外界環(huán)境的感知和應(yīng)對能力是決定其能否感染宿主的關(guān)鍵，在感染宿主時致病菌會遇到許多不同的環(huán)境壓力，而這些壓力對于細(xì)菌而言具有潛在的致命性。阪崎克羅諾腸桿菌污染嬰幼兒配方奶粉被制作以及被攝入體內(nèi)后，必須具有抵抗各種環(huán)境壓力的能力，才能最終存活以引發(fā)人體疾病。酸堿、溫度、膽鹽、滲透壓等是其必須克服的外界環(huán)境壓力。目前，關(guān)于阪崎克羅諾腸桿菌的研究大多集中于對其外膜蛋白的研究以及藥物對其抑制及生物膜的清除等情況，對其致病機(jī)制以及潛在毒力因子的研究還都處于初級階段，這就意味著在該領(lǐng)域仍舊存在著太多的未知。本實驗旨在研究phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌環(huán)境耐受的影響，通過Red同源重組法構(gòu)建基因缺失菌株，從生長曲線、酸堿、溫度、膽鹽、滲透壓方面測定了阪崎克羅諾腸桿菌phoP基因缺失前后對于環(huán)境的耐受能力的變化，分析phoP基因在阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對外界環(huán)境壓力時所起的調(diào)節(jié)作用，對阪崎克洛諾腸桿菌的防控具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌BAA894-NA由本實驗室保存；質(zhì)粒PKD46、PKD3和PCP20 捷晶生物有限公司。

胰蛋白胨大豆瓊脂及肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂、LB肉湯北京路橋技術(shù)有限公司；L-阿拉伯糖、氯霉素（Cm）、羧芐青霉素（Carb）等抗生素 美國MP生化公司；EcoRI內(nèi)切酶及Buffer 美國Thermo公司；高保真酶及PCR體系 北京全式金生物科技有限公司；PCR引物江蘇奧科生物科技公司；膽鹽 美國Sigma公司；電擊杯（2 mm） 美國BTX公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2216MK低溫高速離心機(jī) 德國Hermle公司；9600基因擴(kuò)增儀 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；iQ5實時熒光定量PCR儀、Smart SpecTMplus分光光度計 美國Bio-Rad公司；InfinitcTMM200PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯集團(tuán)公司；JS680B凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；LMQ.C立式滅菌器 山東新華醫(yī)療機(jī)械股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 phoP基因缺失菌株的構(gòu)建

1.3.1.1 引物設(shè)計

通過Primer Premier 5.0進(jìn)行同源重組的引物（phoP-F、phoP-R）的設(shè)計，5’端為實驗菌株阪崎克羅諾腸桿菌的目的基因phoP兩端的同源臂（小寫表示），3’端為用以擴(kuò)增氯霉素抗性基因（其兩側(cè)各攜有1個FRT位點）的引物（大寫表示），通過該引物擴(kuò)增模板PKD3上的氯霉素抗性片段，最后通過DNA純化試劑盒獲得能夠與目的基因phoP發(fā)生同源重組的氯霉素抗性片段。鑒定引物（JD-F、JD-R）則設(shè)計在目的基因的上下游。引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.1.2 電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備

將細(xì)菌劃線活化，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中（25 mL），置于37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)至OD600nm值為0.6，然后置于低溫高速離心機(jī)中5 000 r/min、4 ℃離心10 min，倒掉上清液后用事先預(yù)冷的無菌水洗滌一次，預(yù)冷的10%甘油洗滌2 次，最后濃縮250 倍為100 μL的感受態(tài)細(xì)胞，以每管50 μL的量分裝，置于－80 ℃冰箱備用[16]。

1.3.1.3 氯霉素抗性片段的制備

以PKD3為模板，phoP-F、phoP-R為引物，擴(kuò)增兩側(cè)攜有FRT位點的氯霉素抗性片段。擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)計如下：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。以JD-F、JD-R為引物進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。

1.3.1.4 Red同源重組系統(tǒng)的構(gòu)建

將阪崎克羅諾腸桿菌BAA894-NA制備為感受態(tài)（1.3.1.2節(jié)方法制備），取PKD46質(zhì)粒約150 ng電轉(zhuǎn)入50 μL感受態(tài)。電轉(zhuǎn)化條件參數(shù)：電壓2.5 kV，頻率25 μF，電阻200 Ω，時間4～5 ms。電擊完成后加入1 mL SOB（super optimal broth）液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至無菌試管中，于180 r/min、30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)2 h后，涂布于Carb平板（50 μg/mL）上，30 ℃條件下培養(yǎng)過夜。挑選Carb平板上的陽性重組子接種于25 mL含Carb（50 μg/mL）的SOB培養(yǎng)基中，加入2.5 mLL-阿拉伯糖（1 mol/L）溶液進(jìn)行誘導(dǎo)后，制備成感受態(tài)（按1.3.1.2節(jié)方法制備）。

1.3.1.5 目的基因替換

取氯霉素抗性基因片段約250 ng電轉(zhuǎn)入同源重組系統(tǒng)構(gòu)建成功的感受態(tài)中（電轉(zhuǎn)化條件參數(shù)同1.3.1.4節(jié)所述），電擊完成后加入1 mL SOB液體培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 h，涂布于Cm平板（20 μg/mL），42 ℃培養(yǎng)過夜。用無菌牙簽挑取Cm平板上長出的單菌落，分別點樣于Cm平板、Carb平板和LB平板上，42 ℃培養(yǎng)。挑取能夠在LB平板及Cm平板上生長但在Carb平板上不能生長的單菌落，以JD-F、JD-R為引物進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。

1.3.1.6 耐藥基因的消除

挑選驗證正確的氯霉素抗性重組子制備成感受態(tài)（按1.3.1.2節(jié)方法制備），電轉(zhuǎn)入PCP20質(zhì)粒（電轉(zhuǎn)化條件參數(shù)同1.3.1.4節(jié)所述），涂布于氨芐和Cm雙抗性平板，于30 ℃條件下培養(yǎng)，挑選出陽性重組子轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)液中，42 ℃培養(yǎng)過夜。熱誘導(dǎo)使FLP重組酶得以表達(dá)，從而刪除氯霉素片段以及一個FRT位點。取適量菌液涂布于LB平板，用無菌牙簽挑取平板上長出的單菌落分別點樣于Cm平板、Carb平板和LB平板，最終所得無耐藥性菌株即為phoP基因缺失菌株。以JD-F、JD-R為引物進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，并送樣測序。

1.3.2 菌種活化

取出保藏的實驗菌株，在LB平板上劃線培養(yǎng)后，挑取單菌落于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）中進(jìn)行二次活化，培養(yǎng)18 h致使細(xì)菌處于對數(shù)生長期后期，將活化所得的菌懸液用新鮮的TSB培養(yǎng)液清洗一次（4 ℃，8 000×g，5 min）后，再添加新鮮的TSB培養(yǎng)液，調(diào)整其OD600nm值為0.5（此時菌液濃度約為108CFU/mL）[17]。

1.3.3 生長曲線測定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，稀釋100 倍備用。取出96 微孔板，每孔加入250 μL稀釋的菌液，每個菌株做6 個復(fù)孔，以無菌新鮮的TSB培養(yǎng)液為陰性對照，于37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h測定一次培養(yǎng)液的OD600nm值。繪制菌株的生長曲線圖。

1.3.4 對酸堿耐受的測定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，取出96 微孔板，每孔按1∶1加入菌液和pH 4的新鮮培養(yǎng)基250 μL（125 μL的菌液和125 μL pH 4的新鮮培養(yǎng)基混合），每個菌株做6 個復(fù)孔，以相對應(yīng)的無菌新鮮TSB培養(yǎng)液為陰性對照，以測定菌對酸的耐受性；同樣的，每孔按1∶1加入菌液和pH 12的新鮮培養(yǎng)基250 μL（125 μL的菌液和125 μL pH 12的新鮮培養(yǎng)基混合），每個菌株做6 個復(fù)孔，以相對應(yīng)的無菌新鮮TSB培養(yǎng)液為陰性對照，以測定菌的堿耐受性。放置于37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔1 h測定一次培養(yǎng)液的OD600nm值。繪制菌株的生長曲線圖。

1.3.5 對溫度耐受的測定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，分別以1%的菌濃度接種至新鮮培養(yǎng)液中分別置于55、65 ℃條件下培養(yǎng)，于1、2、5、8、10、20、30 min時，對菌液進(jìn)行10 倍稀釋從而形成不同梯度菌液，將菌液進(jìn)行涂布、點板，于37 ℃條件下過夜，計數(shù)測定活菌數(shù)。

1.3.6 對膽鹽耐受的測定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，分別以1%的菌濃度接種至含不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4%、8%、12%）的培養(yǎng)液中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)。分別在2 h時取樣進(jìn)行10 倍稀釋，進(jìn)行涂布、點板，于37 ℃條件下過夜，計數(shù)，計算存活率。

1.3.7 對滲透壓耐受的測定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，分別以1%的菌濃度接種至NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同（1.5%、3%、6%）的培養(yǎng)液（模擬不同滲透壓環(huán)境）中，放置于37 ℃條件下培養(yǎng)。分別在2、4 h取樣進(jìn)行10 倍稀釋，進(jìn)行涂布、點板，于37 ℃條件下過夜，計數(shù)，計算存活率。

1.3.8 存活率的計算

式中：N0為t時刻純培養(yǎng)液中活菌數(shù)；Nt為t時刻不同條件溶液中活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS軟件22.0版本進(jìn)行分析，采用獨立樣本T檢驗法進(jìn)行分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 phoP基因缺失菌株的構(gòu)建

圖1 PCR鑒定重組子Fig. 1 PCR amplification of positive clones

通過Red同源重組方法成功構(gòu)建阪崎克羅諾腸桿菌phoP基因缺失菌株，通過引物JD-F、JD-R進(jìn)行產(chǎn)物驗證。理論上，野生型菌株C. sakazakii BAA894-NA的PCR產(chǎn)物大小為872 bp，目的基因被成功替換的菌株P(guān)CR產(chǎn)物大小為1 378 bp，而最終的基因缺失菌株的PCR產(chǎn)物大小為448 bp。如圖1所示，顯然，phoP基因缺失菌株的條帶接近500 bp，符合預(yù)期。送樣測序的結(jié)果如下：CGCTTATGCCTTTAGTATAATTGGCGTTAAACTATTTA TATATTTGATGGATAAGGGGACCCCGGATGCGCGTG CTGGTCGTCGAGGATAACGCCTTACTGCGGCATCAC CTGAAAGTGCAGCTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC GGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCAT GGCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGTGTTCCTGTG TCACTGCTGGCGAGGCGATCACGACAGTGCGCGGC CAGGGTTACCGGTTCGATCTGCGCTAAATGAAAAA AAACGTCCTGCGCCACTTTCTCCCGCTCTCGCTGCG GGTGCGCTTTTTACTCGCGACCGCGGCGGTGGTGCT GGTGCTCTCGCTCGCCTACGAGGGGG（下劃線部分為同源臂，框住部分為殘留的一個FRT位點，可見phoP基因被成功敲除）。

2.2 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌生長曲線的影響

圖2 生長曲線的測定Fig. 2 Growth curves

借助酶標(biāo)儀每隔1 h測定一次阪崎克羅諾腸桿菌BAA894-NA以及phoP基因缺失菌株培養(yǎng)液的OD600nm值評估菌的生長，如圖2所示，phoP基因的缺失明顯延緩了阪崎克羅諾腸桿菌的生長速率，在指數(shù)期的尤其是第3、4小時，phoP基因缺失菌株培養(yǎng)液的OD600nm值僅為野生型菌株OD600nm值的41.79%、45.77%。

2.3 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌酸堿耐受的影響

測定阪崎克羅諾腸桿菌野生型菌株以及phoP基因缺失菌株對酸（pH 4）、堿（pH 12）的耐受，如圖3所示，比較阪崎克羅諾腸桿菌在應(yīng)對酸、堿外界刺激培養(yǎng)相同時間時的OD600nm值可以發(fā)現(xiàn)，堿性情況下阪崎克羅諾腸桿菌達(dá)到平緩期的OD600nm值明顯低于在酸性條件下的OD600nm值，由此推測阪崎克羅諾腸桿菌耐酸不耐堿。無論是在酸性或是堿性環(huán)境中，phoP基因缺失菌株在對數(shù)生長期時的生長情況均劣于野生型菌株，可見phoP基因在阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對外界酸堿刺激變化的過程中，確實起到了作用。

圖3 3 phoPphoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌耐酸（a）及a耐堿（b）能力的影響Fig. 3 Effect of phoP on acid (a) and alkaline (b) tolerance of C. sakazakii

2.4 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌溫度耐受的影響

圖 4 pphhooPP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌耐受溫度55 ℃（a）和65 ℃（b）的影響Fig. 4 Effect of phoP on temperature tolerance of C. sakazakii at 55 ℃ (a) and 65 ℃ (b)

阪崎克羅諾腸桿菌對溫度（55、65 ℃）的耐受結(jié)果如圖4 所示，55 ℃條件下，30 min時phoP基因缺失菌株已完全被殺滅，低于檢測線，而野生型菌株在30 min時仍然有存活；65 ℃條件下，phoP基因缺失菌株完全滅活只需5 min，而野生型菌株在該溫度下經(jīng)過8 min時才失去活性。

2.5 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌膽鹽耐受的影響

圖5 5 phoPphoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌耐膽鹽能力的影響Fig. 5 Effect of phoP on bile salt tolerance of C. sakazakii

如圖5所示，phoP基因的缺失減弱了阪崎克羅諾腸桿菌對于膽鹽的耐受力。隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，阪崎克羅諾腸桿菌的存活率呈現(xiàn)出遞減趨勢，并且phoP基因缺失菌株在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽溶液中的生長狀況均劣于野生型菌株。培養(yǎng)2 h時，在含4%的膽鹽溶液中培養(yǎng)后，阪崎克羅諾腸桿菌的phoP基因缺失菌株的存活率比野生型菌株的顯著降低了19.93%（P＜0.05），在含8%、12%膽鹽溶液中培養(yǎng)后的阪崎克羅諾腸桿菌，phoP基因缺失菌株的存活率與野生型菌株相比極顯著降低了40.73%和45.84%（P＜0.01）。

2.6 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌滲透壓耐受的影響

圖6 6 phoPphoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌滲透壓耐受力的影響Fig. 6 Effect of phoP on osmotic pressure tolerance of C. sakazakii

利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl溶液模擬不同滲透壓環(huán)境，如圖6所示，phoP基因缺失后，阪崎克羅諾腸桿菌對于滲透壓的耐受力降低，基因缺失菌株與野生型菌株相比均顯著降低（P＜0.05）。且隨著滲透壓環(huán)境壓力的增大，阪崎克羅諾腸桿菌的活性呈遞減趨勢。

3 討 論

Red同源重組技術(shù)不需要酶切連接等復(fù)雜過程，已經(jīng)被應(yīng)用于大腸桿菌、克羅諾氏菌、假單胞菌、沙門氏菌等[18-19]。楊汐靜等[20]通過Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建大腸桿菌膜外蛋白A的缺失菌株以探究OmpA基因?qū)Υ竽c桿菌的生長影響。陶明新[21]依據(jù)此同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門菌的sipA基因缺失菌株以探究其致病性。本實驗通過Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建獲得阪崎克羅諾腸桿菌的phoP基因缺失菌株，為探究該基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌環(huán)境耐受力的影響提供了研究依據(jù)。

實驗結(jié)果表明，就阪崎克羅諾腸桿菌的生長狀態(tài)而言，phoP基因的缺失明顯延緩了菌的生長速率。在第3、4小時時，phoP基因缺失菌株培養(yǎng)液的OD600nm值僅為野生型菌株OD600nm值的41.79%、45.77%，可見phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌的生長狀況具有一定的調(diào)節(jié)作用。這與Lin Zhiwei等[22]在志賀氏桿菌中發(fā)現(xiàn)的結(jié)論相符合。

酸堿耐受能力測定的實驗結(jié)果表明，phoP基因在阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對外界酸堿刺激變化的過程中，確實起到作用。就體內(nèi)而言，胃酸因其強(qiáng)酸性在很大程度上阻礙了致病菌的致病性。Bearson等[23]研究表明PhoP本身就是一種酸休克蛋白，phoP基因的缺失可能會略微增加有機(jī)酸的滲透性進(jìn)而影響細(xì)菌。Lin Zhiwei等[22]報道中指出PhoP/PhoQ系統(tǒng)調(diào)控了志賀氏桿菌對pH值的應(yīng)激反應(yīng)，其存在使得志賀氏桿菌能夠耐受低酸環(huán)境，促使該菌更快適應(yīng)環(huán)境生長，這點與本實驗結(jié)果相符合，即phoP基因使得阪崎克羅諾腸桿菌在一定程度上更耐酸堿。相對成人而言，嬰幼兒的胃酸pH值要高一些，由母乳喂養(yǎng)的嬰兒胃酸值約2.7，而由奶粉喂養(yǎng)的嬰兒胃酸值更高為3.6左右，加上進(jìn)食之后胃酸被稀釋，pH值隨之升高，這也是嬰幼兒更容易被阪崎克羅諾腸桿菌感染致病的原因。柴云雷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾腸桿菌對酸的耐受力較強(qiáng)，但對堿耐受力弱，究其原因可能因為阪崎克羅諾腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁富含脂類物質(zhì)從而易與堿發(fā)生反應(yīng)，致使細(xì)胞膜破裂引發(fā)菌死亡。

阪崎克羅諾腸桿菌在6～45 ℃條件下均能生長，最佳生長溫度為25～37 ℃[25]。通過熱壓能力測定的實驗結(jié)果可知，隨著溫度的升高，阪崎克羅諾腸桿菌的存活時間變短，而phoP基因的缺失會導(dǎo)致菌的滅活時間進(jìn)一步被縮短，由此可見，phoP基因起到了輔助阪崎克羅諾腸桿菌抵御外界熱壓的作用。對于阪崎克羅諾腸桿菌的防治與殺滅多體現(xiàn)應(yīng)用于奶粉中，為避免奶粉中其他營養(yǎng)物質(zhì)因高溫而被破壞，溫度不能過高。有關(guān)研究表明，巴斯德滅菌的溫度能夠殺滅阪崎克羅諾腸桿菌使其不得存活，故該菌的感染可能來自后續(xù)加工，猜測奶粉中的蛋白質(zhì)、糖類等成分可能在一定程度上增加了阪崎克羅諾腸桿菌的耐熱能力[24]。

膽汁是在消化系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的，另一種殺菌物質(zhì)膽鹽作為膽汁的重要構(gòu)成成分，已經(jīng)被證實具有殺菌作用，是阪崎克羅諾腸桿菌在胃腸道內(nèi)存活必須克服的一個主要壓力因素[26]。近年來，很多學(xué)者都致力于研究膽鹽在抑菌過程中起的作用，特別是對腸道內(nèi)細(xì)菌的作用，據(jù)推測，膽鹽的分泌能力與細(xì)菌的致病力直接相關(guān)[27]。Velkinburgh等[28]研究顯示，缺少PhoP/PhoQ調(diào)控系統(tǒng)的傷寒沙門氏菌突變株對膽汁的耐受濃度顯著低于野生型菌株，證實鼠傷寒沙門氏菌對膽汁的高水平抗性依賴于PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)。本實驗結(jié)果顯示，phoP基因缺失菌株在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽溶液中的生長狀況均劣于野生型菌株，由此推測，phoP基因能促使阪崎克羅諾腸桿菌更快適應(yīng)膽鹽應(yīng)激反應(yīng)。

滲透壓是威脅阪崎克羅諾腸桿菌在奶粉中存活的另一大阻礙，奶粉的水分活度低至0.2，這意味著阪崎克羅諾腸桿菌要 存活下來則必須克服高滲透壓環(huán)境。álvarez-Ordó?ez等[29]研究表明，在滲透壓作用下，蛋白質(zhì)的再生、大分子的損傷修復(fù)、細(xì)胞 膜結(jié)構(gòu)的維護(hù)及完整性以及一些代謝活動對細(xì)菌的存活至關(guān)重要。Yuan Jing等[30]將PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)與滲透傳感聯(lián)系起來，其研究表明缺乏phoP基因的菌株面臨高滲情況時，與野生型菌株相比表現(xiàn)出明顯的生長滯后，證明了PhoP/PhoQ在高滲透壓環(huán)境中能夠加速細(xì)胞的修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，phoP基因缺失導(dǎo)致阪崎克羅諾腸桿菌對于滲透壓的耐受力降低，與前人有關(guān)的研究結(jié)果相符合。

4 結(jié) 論

探究phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌環(huán)境耐受的影響，通過Red同源重組基因敲除手段，成功構(gòu)建出阪崎克羅諾腸桿菌的phoP基因缺失菌株。在此基礎(chǔ)上，通過測定并繪制阪崎克羅諾腸桿菌野生型菌株和phoP基因缺失菌株的生長曲線發(fā)現(xiàn)，phoP基因的缺失在一定程度上降低了阪崎克羅諾腸桿菌的生長速率。從酸堿環(huán)境耐受實驗看，阪崎克羅諾腸桿菌表現(xiàn)出耐酸不耐堿的性質(zhì)，野生型菌株對酸堿的耐受力優(yōu)于phoP基因缺失菌株。其次，對于溫度耐受能力測定的結(jié)果表明，phoP基因的缺失使得細(xì)菌的熱致死時間變短，phoP基因起到了輔助阪崎克羅諾腸桿菌抵御外界熱壓的作用；再者，選取4%、8%、12%膽鹽溶液對阪崎克羅諾腸桿菌的膽鹽耐受力進(jìn)行測定，結(jié)果表明隨膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，阪崎克羅諾腸桿菌的存活率呈遞減趨勢，phoP基因有利于阪崎克羅諾腸桿菌在膽鹽溶液中存活；最后，對于滲透壓環(huán)境的耐受實驗表明，phoP基因也有助于阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對高滲環(huán)境以存活。綜上所述，phoP基因有利于阪崎克羅諾腸桿菌的生長以適應(yīng)外界環(huán)境壓力。實驗結(jié)果為進(jìn)一步研究阪崎克羅諾腸桿菌的生長特性及致病力提供一定理論依據(jù)。