楊 慧，陳德經(jīng),,*，夏冬輝，辛 茜，陳海濤，金文剛

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001；3.陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001；4.漢中龍?chǎng)F生物工程股份有限公司，陜西 漢中 723001）

大鯢（Andrias davidianus），俗稱“娃娃魚(yú)”，屬有尾目，隱鰓鯢科，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動(dòng)物，有“生物界活化石”的美稱[1]。大鯢被列入人工繁育國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)水生野生動(dòng)物名錄，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)人工繁育養(yǎng)殖的子二代大鯢可加工利用[2]。大鯢具有很高的食用和藥用價(jià)值，黃世英等[3]對(duì)人工養(yǎng)殖的大鯢肉營(yíng)養(yǎng)成分分析表明，大鯢肉蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸、鮮味氨基酸含量豐富，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值高達(dá)3.15，遠(yuǎn)高于雞蛋、豬肉、蝦。劉紹等[4]分析了大鯢肌肉中必需脂肪酸，主要為亞油酸、亞麻酸、DHA、花生四烯酸。此外，大鯢肌肉中含有鈣、鐵、鋅、硒等礦質(zhì)物質(zhì)，其中鋅含量遠(yuǎn)高于魚(yú)、蝦、蟹、貝類等[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，經(jīng)常食用大鯢肉可以益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能，對(duì)心腦血管疾病、惡性貧血、惡性腫瘤、癌癥等有很好的預(yù)防作用。曹潔等[6]研究了大鯢肉粉對(duì)小鼠免疫功能和抗疲勞作用的影響，表明大鯢肉粉具有增強(qiáng)小鼠免疫力和抗疲勞的功能。此外，大鯢體內(nèi)含金屬硫蛋白，能清除人體自由基和重金屬離子，具有很好的解毒作用[7-8]。

大鯢肉粉是大鯢保健品的原料之一。目前，市場(chǎng)售賣的活體大鯢約50～100 元/斤，將其加工成大鯢肉粉其價(jià)格將翻幾番，有不法商販為牟取暴利，會(huì)在大鯢肉粉中摻入與其顏色較接近的低價(jià)位肉類和其他物質(zhì)，如魚(yú)粉、淀粉等。這不僅損害消費(fèi)者的利益，同時(shí)也擾亂了大鯢市場(chǎng)的健康發(fā)展。因此，建立一種快速識(shí)別摻偽大鯢肉粉的方法就顯得尤為重要。傳統(tǒng)肉類摻偽鑒別常用方法有感官檢驗(yàn)法[9]、生物技術(shù)法[10]、光譜法[11]和電子感官鑒別技術(shù)（電子鼻和電子舌）[12]等，但這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、分析過(guò)程繁瑣、重現(xiàn)性差且成本高等缺點(diǎn)。近年來(lái)，近紅外光譜技術(shù)因具快捷、簡(jiǎn)便、無(wú)損且重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[13]，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)畜產(chǎn)品[14]、果蔬[15]、乳制品[16]、油脂品[17]和肉制品摻偽鑒別中。張麗華等[18]采用近紅外光譜結(jié)合支持向量機(jī)模型對(duì)牛肉中摻雜鴨肉進(jìn)行鑒別，其建模集正確率為97.09%，檢驗(yàn)集正確率為94%。牛小穎等[19]采用近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法鑒別了驢肉摻偽，校正集和預(yù)測(cè)集的判別正確率均為100%。Morsy等[20]采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)新鮮及冷凍碎牛肉中摻雜豬肉、修剪脂肪、內(nèi)臟等進(jìn)行了鑒別，其所建模型的識(shí)別正確率高達(dá)100%。目前鮮見(jiàn)近紅外鑒別大鯢肉粉的相關(guān)文獻(xiàn)。

偏最小二乘（partial least square，PLS）法是目前近紅外光譜分析中應(yīng)用最廣泛的數(shù)據(jù)建模方法，其可以綜合篩選光譜數(shù)據(jù)，提取信息變量[21]。其中，偏最小二乘-判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）法[22]和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析法[23]分別用于判別分析和定量校正。

本實(shí)驗(yàn)以大鯢肉粉為研究對(duì)象，分別摻入不同比例的草魚(yú)肉粉、江團(tuán)魚(yú)肉粉和土豆淀粉，探索采用PLS法定性定量分析摻偽大鯢肉粉的可行性，以期為摻偽大鯢肉粉的快速檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大鯢肉樣 漢中龍?chǎng)F生物工程股份有限公司；草魚(yú)、江團(tuán)魚(yú) 漢中當(dāng)?shù)厮a(chǎn)店；土豆淀粉 自制。

1.2 儀器與設(shè)備

VERTEX 70紅外光譜儀（配備OPUS 7.5光譜采集軟件和漫反射積分球附件） 德國(guó)布魯克有限公司；LGJ-10B冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；BCD-486WDEG冰箱 青島海爾股份有限公司；XH-D旋渦混合器 上海利聞科學(xué)儀器有限公司；DFY-1000搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；ME104E電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

大鯢肉樣、江團(tuán)魚(yú)肉樣和草魚(yú)肉樣經(jīng)液氮速凍、粉碎后置于冷凍干燥機(jī)中干燥，研磨，過(guò)60 目篩，得到細(xì)粉。然后在大鯢肉粉中分別摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～40%（1%、2%、3%…40%）的江團(tuán)魚(yú)肉粉（n=40）、草魚(yú)肉粉（n=40）和土豆淀粉（n=40），保持混合樣總量為0.300 g，置于2 mL的離心管中，旋渦混合器上混勻。

1.3.2 光譜采集

將樣品放入石英杯中混合均勻，以儀器內(nèi)置背景為參比，采用積分球漫反射方式采集樣品（40 個(gè)大鯢純?nèi)鈽印?0 個(gè)大鯢摻江團(tuán)魚(yú)肉樣、40 個(gè)大鯢摻草魚(yú)肉樣和40 個(gè)大鯢摻土豆淀粉樣）的近紅外光譜圖，掃描范圍4 000～10 000 cm－1，分辨率8 cm－1，累計(jì)掃描次數(shù)64 次，每個(gè)樣本重復(fù)掃描3 次，用于后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

對(duì)采集的160 個(gè)光譜進(jìn)行2分類和4分類的分類建模分析，每類隨機(jī)選擇80%的樣本作為校正集，用于建立PLS-DA模型；每類剩余20%的樣本作為測(cè)試集，用于驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)能力。對(duì)原始光譜經(jīng)多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（standard normal variate transformation，SNV）和一階導(dǎo)數(shù)（1st derivative，1SGD）、1SGD+MSC、1SGD+SNV等光譜預(yù)處理后，對(duì)所建判別模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

同時(shí)，為快速檢測(cè)摻偽樣的純度，采用PLSR分析法分別建立3 類摻偽樣中的大鯢肉粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的定量校正模型。3 類摻偽樣定量模型中，每類分別隨機(jī)選取70%的樣本（28 個(gè)樣本）為校正集，用于建立定量校正模型，其余30%的樣本（12 個(gè)樣本）為測(cè)試集，用于驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)性能。以校正集的10-折交互驗(yàn)證誤差均方根（root mean squares error of cross-validation，RMSECV）確定建模的主因子數(shù)，以校正集的均方根誤差（root mean square for calibration，RMSEC）和校正集相關(guān)系數(shù)（R2c）為指標(biāo)優(yōu)化模型參數(shù)，以測(cè)試集的均方根誤差（root mean square for prediction，RMSEP）和測(cè)試集的相關(guān)系數(shù)（Rp2）考察模型的預(yù)測(cè)性能。

在Matlab R2014a環(huán)境下，采用PLS tool box 5.5程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 近紅外光譜圖

2.1.1 大鯢純樣和摻偽物近紅外光譜圖

由圖1可知，大鯢純?nèi)鈽拥慕t外光譜曲線形狀相似，選取的40 條大鯢制備的肉粉差異不大。該批次的大鯢魚(yú)苗均購(gòu)置于同一養(yǎng)殖戶，其種齡、生長(zhǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)環(huán)境完全相同，說(shuō)明商品大鯢制備的肉粉無(wú)差異。近紅外光譜主要反映的是含氫元素的化學(xué)基團(tuán)分子振動(dòng)的倍頻和合頻吸收信息[24]，大鯢純?nèi)夥鄣墓庾V在8 408、5 761、6 606、4 350 cm－1和4 047 cm－1附近有特征吸收峰。8 408、5 761 cm－1是C—H伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻，6 606 cm－1是O—H伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻，4 597 cm－1是N—H伸縮振動(dòng)和N—H變角振動(dòng)的組頻，4350 cm－1是O—H伸縮振動(dòng)和O—H變角振動(dòng)的組頻，4 047 cm－1是C—H伸縮振動(dòng)和C—H變角振動(dòng)的組頻[25]。

圖1 大鯢純?nèi)鈽拥慕t外光譜圖Fig. 1 Near-infrared spectra of pure Chinese giant salamander meat samples

圖2 4 種純樣的平均光譜圖Fig. 2 Average spectra of four pure samples

由圖2可知，土豆淀粉的近紅外圖譜和其他肉類的圖譜有顯著差異，純江團(tuán)肉粉、純草魚(yú)肉粉純和大鯢肉粉的近紅外光譜圖形狀極為相似，這可能是因?yàn)樗鼈兌家缘鞍踪|(zhì)物質(zhì)為主。在波數(shù)為8 700～6 500 cm－1、5 000～4 000 cm－1范圍內(nèi)，可用肉眼識(shí)別3 種純?nèi)鈽拥墓庾V圖，且江團(tuán)魚(yú)粉的吸光度最大的，大鯢肉粉的吸光度最低。肉類品種不同，其所含有的化學(xué)成分也不同，因此表現(xiàn)出不同的近紅外光譜吸收值，這也是近紅外技術(shù)應(yīng)用于肉類摻假檢驗(yàn)的基本原理[26]。土豆淀粉是一種多糖，其組成成分與肉制品有顯著差異，因此在4 000～7 000 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)，肉眼可直接識(shí)別純大鯢肉粉和純土豆淀粉。

2.1.2 摻偽大鯢肉粉的近紅外光譜圖

圖3 大鯢肉粉摻偽近紅外光譜圖Fig. 3 Near infrared spectra of adulterated Chinese giant salamander meat powder

比較圖2與圖3可以看出，大鯢肉粉摻偽光譜圖出現(xiàn)譜峰重疊現(xiàn)象，且隨著摻假物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（從下到上遞增）的不斷增加，重疊現(xiàn)象隨之加重，很難用肉眼直接區(qū)分大鯢純?nèi)鈽雍痛篥F摻偽樣，此時(shí)就需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.2 定性分析結(jié)果

表1 不同光譜預(yù)處理方法所建摻偽大鯢肉粉PLS-DA（2分類）模型判別結(jié)果Table 1 Discrimination of adulterated and authentic samples by PLS-DA models with different spectral pretreatments

近紅外光譜建模分析時(shí)，其譜圖中的噪音、基線漂移、光散射等現(xiàn)象會(huì)影響模型的性能，因此需要對(duì)原始光譜預(yù)處理，以提高模型準(zhǔn)確性[24]。目前，有許多預(yù)處理方法可用于近紅外光譜數(shù)據(jù)的處理[27]。在確定具體方法或組合方式前，很難確定最佳的光譜預(yù)處理方法[28-29]。近年來(lái)，有人提出了基于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法解決這一問(wèn)題[30-31]，但仍有不足之處。因此，試錯(cuò)法仍然是目前最常用的方法。本實(shí)驗(yàn)采用MSC、SNV、1SGD、1SGD+MSC和1SGD+SNV五種光譜預(yù)處理方法。光譜預(yù)處理后，采用PLS-DA方法分別建立2分類和4分類的分類判別模型，以此確定最佳的光譜預(yù)處理方法。

由表1可看出，模型預(yù)測(cè)效果不一，經(jīng)光譜預(yù)處理后，模型的準(zhǔn)確率均有提高。其中經(jīng)1SGD+MSC光譜預(yù)處理后，模型校正集和預(yù)測(cè)集的準(zhǔn)確率均為100%。該模型可以區(qū)分開(kāi)大鯢純?nèi)鈽雍蛽絺螛印?/p>

表2 不同光譜預(yù)處理方法所建摻偽大鯢肉粉PLS-DA（4分類）模型判別結(jié)果Table 2 Discrimination of three adulterated samples and authentic sample by PLS-DA models with different spectral pretreatments

由表2可以看出，各類判別模型的主因子數(shù)均為5，但模型校正集和預(yù)測(cè)集的準(zhǔn)確率不同。其中1SGD+MSC光譜預(yù)處理效果最優(yōu)，校正集和測(cè)試集的準(zhǔn)確率高達(dá)100%。其他預(yù)處理方法均有誤判數(shù)，但準(zhǔn)確率也在原始光譜之上。該模型可以區(qū)分開(kāi)大鯢純?nèi)鈽印⒋篥F摻江團(tuán)魚(yú)肉樣、大鯢摻草魚(yú)肉樣和大鯢摻土豆淀粉樣。

這可能是由于一階導(dǎo)數(shù)可對(duì)樣品差異導(dǎo)致的基線漂移具有消除作用，多元散射校正可消除樣品顆粒度和顆粒大小不均勻造成的散射影響，因此譜帶特征有所強(qiáng)化，譜帶重疊現(xiàn)象有所改善[24,32]。成芳等[33]比較了不同光譜預(yù)處理方法（MSC、SNV、一階導(dǎo)數(shù)及不同點(diǎn)數(shù)平滑）對(duì)不同部位豬肉糜所建的PLS-DA模型的影響，發(fā)現(xiàn)一階導(dǎo)數(shù)光譜預(yù)處理方法可使模型校正集和預(yù)測(cè)集的準(zhǔn)確度分別達(dá)到100%和96%。Kamruzzaman等[34]比較了MSC、SNV、一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)等光譜預(yù)處理方法對(duì)牛肉摻馬肉定量模型的影響，發(fā)現(xiàn)相較于處理過(guò)的光譜，原始光譜的效果更好。徐文杰等[35]為建立最優(yōu)的淡水魚(yú)魚(yú)種鑒別模型，采用MSC、標(biāo)準(zhǔn)化、正交信號(hào)校正、去趨勢(shì)校正、SNV、平滑、導(dǎo)數(shù)、基線校正等20 種光譜預(yù)處理方法，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，模型效果最優(yōu)。由此可見(jiàn)，最優(yōu)光譜預(yù)處理方法的選擇和確定隨分析檢測(cè)對(duì)象的不同而存在差異。故本實(shí)驗(yàn)確定1SGD+MSC為最優(yōu)光譜預(yù)處理方法。

2.3 定量分析結(jié)果

建立PLS定量模型時(shí)，主因子數(shù)目會(huì)顯著影響PLS定量分析模型的預(yù)測(cè)結(jié)果。主因子數(shù)目過(guò)多，模型會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象；主因子數(shù)過(guò)少，模型的預(yù)測(cè)能力弱[36]。本實(shí)驗(yàn)采取10-折交互驗(yàn)證法，根據(jù)校正集RMSECV的變化值判斷主因子數(shù)對(duì)PLS定量分析模型的影響，獲得定量分析的最適主因子數(shù)。

圖4 江團(tuán)魚(yú)肉粉摻偽定量分析結(jié)果Fig. 4 Quantitative model of adulteration of longsnout catfish meat powder

由圖4A可見(jiàn)，大鯢摻江團(tuán)魚(yú)肉粉定量分析的最適主因子數(shù)為6。圖4B中大鯢摻江團(tuán)魚(yú)肉粉定量模型的RMSEC和RMSEP分別為1.14%和0.83%，為0.990 6，為0.994 4。

圖5 草魚(yú)肉粉摻偽定量分析結(jié)果Fig. 5 Quantitative model of adulteration of grass carp meat powder

由圖5A可見(jiàn)，大鯢摻草魚(yú)肉粉定量分析的最適主因子數(shù)為11。圖5B中大鯢粉摻草魚(yú)肉粉定量模型的RMSEC和RMSEP分別為1.39%和0.89%，R2c為0.986 4，Rp2為0.992 4。

圖6 土豆淀粉摻偽定量分析結(jié)果Fig. 6 Quantitative model of adulteration of potato starch

由圖6可見(jiàn)，大鯢摻土豆淀粉定量分析的最適主因子數(shù)為10。圖6B中大鯢粉摻土豆淀粉定量模型的RMSEC和RMSEP分別為0.88%和1.22%，Rc2為0.993 3，Rp2為0.990 8。

3 結(jié) 論

運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合PLS-DA建立摻偽大鯢肉粉的定性鑒別方法。PLS-DA模型中，比較大鯢肉粉及其摻偽物的原始光譜以及經(jīng)MSC、SNV、1SGD、1SGD+MSC和1SGD+SVN等光譜預(yù)處理后所建模型判別效果。確定1SGD+MSC為最佳光譜預(yù)處理方法，所建2分類和4分類模型校正集與預(yù)測(cè)集的準(zhǔn)確率均為100%。

運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合PLSR建立摻偽大鯢肉粉定量校正模型，大鯢肉粉摻江團(tuán)魚(yú)肉粉、大鯢肉粉摻草魚(yú)肉粉、大鯢肉粉摻土豆淀粉模型RMSEC分別為1.14%、1.39%、0.88%，為0.990 6、0.986 4、0.993 3；RMSEP分別為0.83%、0.89%、1.22%，為0.994 4、0.992 4和0.990 8，所建PLSR定量模型有很好的預(yù)測(cè)性能。近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能夠?qū)Υ篥F肉粉進(jìn)行摻偽鑒別和純度檢測(cè)。