陸海游，張 怡，童應(yīng)凱，何煒璐，舒珊珊，張淇珊，牛家蕾

(天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境生物技術(shù)系 天津300384)

0 引 言

近年來(lái)，我國(guó)小麥年產(chǎn)量已超過(guò) 1億噸，加工后的麥麩每年可達(dá) 2000多萬(wàn)噸，它是主要的農(nóng)副產(chǎn)品資源之一[1]。由于麩皮容易獲得且成本較經(jīng)濟(jì)，以麩皮和玉米粉為底料培養(yǎng)菌種生產(chǎn)生物飼料，在養(yǎng)殖業(yè)的實(shí)際應(yīng)用中有重要意義。目前，用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的菌株主要是霉菌、酵母菌和細(xì)菌[2-3]。

本研究選用產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵菌種。有關(guān)研究表明：經(jīng)過(guò)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)加工處理后，產(chǎn)朊假絲酵母菌可適用于現(xiàn)代新型功能食品的加工和食用[4]。在21世紀(jì)初，產(chǎn)朊假絲酵母在一些歐美國(guó)家的飼料工業(yè)中被廣泛用作優(yōu)良的飼料蛋白，或用于其他農(nóng)作物材料，如稻草和油菜籽餅的發(fā)酵，并作為飼料蛋白質(zhì)生產(chǎn)或者排毒[5]。目前其廣泛用于醫(yī)藥、食品工業(yè)和其他化妝品原料，并經(jīng) FDA批準(zhǔn)可用于食品添加劑的安全酵母[6]。因此，利用產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)飼用添加劑或發(fā)酵劑具有良好的應(yīng)用前景。

本研究旨在利用固體發(fā)酵方法，嘗試添加麩皮與玉米粉來(lái)優(yōu)化產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，以提高其生產(chǎn)力并為單細(xì)胞蛋白的應(yīng)用創(chuàng)造有利條件[7]，從而為新型的營(yíng)養(yǎng)飼料提供一個(gè)良好的研究基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母：天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 種子液培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(%)：酵母膏1.0，蛋白胨2.0，葡萄糖2.0，pH值6.0，115℃滅菌20min。

1.1.3 種子液制備

將產(chǎn)朊假絲酵母菌接種于 YEPD液體培養(yǎng)基中，搖床30℃、180r/min培養(yǎng)20h。

1.1.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法

用 250mL三角瓶裝料 10g(9g麩皮+1g玉米粉)為底物，加入 0.5%硫酸銨、0.05%磷酸二氫鉀、9%葡萄糖，再加入一定量蒸餾水，攪拌均勻后115℃滅菌20min，然后接入種子液，30℃發(fā)酵。

硫酸銨溶液制備：將 2.5g硫酸銨溶于50mL蒸餾水中，固體培養(yǎng)基中添加1mL硫酸銨溶液。

磷酸二氫鉀溶液制備：將0.25g磷酸二氫鉀溶于50mL蒸餾水中，固體培養(yǎng)基中添加 1mL磷酸二氫鉀溶液。

葡萄糖溶液制備：將 11.25g葡萄糖溶于 50mL蒸餾水中，固體培養(yǎng)基中添加4mL葡萄糖溶液。

1.2 單因素試驗(yàn)方法

1.2.1 接種量單因素試驗(yàn)

利用上文1.1.4的方法，將接種量設(shè)為4%、8%、12%，分別加入7mL蒸餾水，形成1∶1.3的料液比，進(jìn)行固體發(fā)酵 2d，然后測(cè)定產(chǎn)朊假絲酵母數(shù)量，得到固體發(fā)酵最佳接種量。

1.2.2 加水量單因素試驗(yàn)

利用上文1.1.4的方法，采用1.2.1中確定的最佳接種量，將加水量設(shè)為 100%、150%、200%、250%，即料液比為 1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，固體發(fā)酵2d，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，測(cè)定產(chǎn)朊假絲酵母數(shù)量，得到固體發(fā)酵中最佳加水量。

1.2.3 發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)

利用上文1.1.4的方法，采用1.2.1與1.2.2試驗(yàn)結(jié)果，將發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為 12、24、36、48、60h，發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定產(chǎn)朊假絲酵母數(shù)量，從而確定最佳固體發(fā)酵時(shí)間。

1.3 正交試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)添加劑的正交試驗(yàn)

以 9g麩皮和 1g玉米粉為底物，根據(jù)單因素試驗(yàn) 1.2所得結(jié)果，對(duì)硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖4種添加劑進(jìn)行L9(43)的正交試驗(yàn)，確定其最佳固體發(fā)酵配方，正交表設(shè)計(jì)如表1和表2所示。

表1 正交試驗(yàn)各因素所占百分比Tab.1 Percentage of each factor in orthogonal test

由于加入量較少，需將各因素配制成溶液以便添加：①將 5g硫酸銨加水定容至 50mL容量瓶中；②將0.05g硫酸鎂加水定容至50mL容量瓶中；③將0.5g磷酸二氫鉀加水定容至 50mL容量瓶中；④將20g葡萄糖加水定容至100mL容量瓶中。

表2 正交試驗(yàn)處理Tab.2 Implementation table of orthogonal test

將表2所處理試劑分別加入刻度試管，置于以9g麩皮和 1g玉米粉為底物的固體培養(yǎng)基中，再加入蒸餾水(加水量為 1.2.2試驗(yàn)結(jié)果)，充分?jǐn)嚢?，?jīng)過(guò)高壓滅菌后，進(jìn)行接種(接種量為 1.2.1試驗(yàn)結(jié)果)，攪拌均勻。接種完成后，將樣品放入 30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(培養(yǎng)時(shí)間為 1.2.3試驗(yàn)結(jié)果)，測(cè)定菌種數(shù)量，根據(jù)極差分析法分析得到最佳試驗(yàn)結(jié)果，選出最佳培養(yǎng)基配方。

1.3.2 正交驗(yàn)證試驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)所得最佳配方，進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得酵母菌數(shù)，確定最佳配方實(shí)驗(yàn)的正確性。

1.4 產(chǎn)朊假絲酵母菌菌數(shù)測(cè)定方法

培養(yǎng)后樣品稱取 1g，倒入離心管，加入 20mL蒸餾水，振蕩離心約1min后，另取試管加入9mL蒸餾水及1mL離心液混勻，取100μL注入血球計(jì)數(shù)板凹槽，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。測(cè)菌數(shù)(稀釋倍數(shù)為200，樣品量為1g)，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量試驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)設(shè)定不同接種量，探究接種量對(duì)于產(chǎn)朊假絲酵母固體發(fā)酵的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 接種量試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of inoculation volume test

由圖1可知，在固體培養(yǎng)基中接種量為 4%時(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量為 1.055×109個(gè)/g；接種量為8%時(shí)，酵母菌數(shù)為 1.085×109個(gè)/g；接種量為 12%時(shí)，酵母菌數(shù)最多，達(dá) 1.374×109個(gè)/g。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著接種量的增加，固體發(fā)酵體系中產(chǎn)朊假絲酵母數(shù)量增多。主要是由于菌種接種量越多，越容易在有限時(shí)間內(nèi)快速達(dá)到菌種數(shù)量的最大值。但接種量不是越多越好，因?yàn)榻臃N量過(guò)大，一是會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，二是會(huì)造成菌種間競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，反而抑制固體發(fā)酵的有效進(jìn)行。所以在后續(xù)正交試驗(yàn)中，選取接種量為12%。

2.2 加水量試驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)設(shè)定不同加水量，探究加水量對(duì)于產(chǎn)朊假絲酵母固體發(fā)酵的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)固體發(fā)酵體系中料液比為 1∶1時(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)為 1.136×109個(gè)/g，獲得的酵母菌數(shù)最多；當(dāng)料液比為 1∶1.5時(shí)，酵母菌數(shù)為1.074×109個(gè)/g；當(dāng)料液比為 1∶2時(shí)，酵母菌數(shù)為1.048×109個(gè)/g；當(dāng)料液比為 1∶2.5時(shí)，酵母菌數(shù)為1.055×109個(gè)/g。料液比與產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量的關(guān)系整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，但總體上看，后期趨勢(shì)變化不太明顯。說(shuō)明料液比為 1∶1時(shí)，酵母菌能更好與固體發(fā)酵底物接觸，從而能達(dá)到更好的發(fā)酵效果；當(dāng)加水量過(guò)多時(shí)，一方面會(huì)稀釋加入的微量元素，導(dǎo)致酵母菌吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)效率下降，另一方面加水量過(guò)大會(huì)造成發(fā)酵體系含氧量下降，影響酵母菌有氧代謝。因此在正交試驗(yàn)中，選擇料液比為 1∶1，可以更好地進(jìn)行麩皮固體發(fā)酵。

圖2 加水量試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of water addition test

2.3 發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)設(shè)定不同的發(fā)酵時(shí)間，探究不同階段的發(fā)酵時(shí)間對(duì)于產(chǎn)朊假絲酵母固體發(fā)酵的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of fermentation time test

由圖3可知，在發(fā)酵經(jīng)過(guò)12h時(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)為 1.91×108個(gè)/g，在發(fā)酵經(jīng)過(guò) 24h時(shí)，酵母菌數(shù)為 6.36×108個(gè)/g；在發(fā)酵經(jīng)過(guò) 36h時(shí)獲得的酵母菌數(shù)量最多，酵母菌數(shù)達(dá)到 1.304×109個(gè)/g；在 48h時(shí)，酵母菌數(shù)為 1.035×109個(gè)/g；在 60h時(shí)，酵母菌數(shù)為 1.095×109個(gè)/g。由于后期變化不太明顯，可以初步判斷發(fā)酵時(shí)間與產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量的關(guān)系整體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。通過(guò)分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)朊假絲酵母菌在 36h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)固體發(fā)酵體系營(yíng)養(yǎng)物充足，菌種間暫時(shí)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，菌種生長(zhǎng)代謝極為活躍；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，菌種間逐漸產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，致使菌種數(shù)量逐漸下降。所以在后續(xù)的正交試驗(yàn)中，選擇菌種發(fā)酵時(shí)間為正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的36h，作為產(chǎn)朊假絲酵母菌固體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

基于 2.1、2.2和 2.3的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行添加劑的正交試驗(yàn)，測(cè)定產(chǎn)朊假絲酵母菌的數(shù)量后，通過(guò)極差分析選出最佳添加劑配方，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Analysis results of orthogonal test

根據(jù)表3中 K值可知，能獲得最多產(chǎn)朊假絲酵母菌生物量的配方是：0.5%硫酸銨，0.05%磷酸二氫鉀，6%葡萄糖，即 4號(hào)試驗(yàn)為最佳配方組，所得的產(chǎn)朊假絲酵母菌生物量最高。通過(guò)R值的分析可知，影響正交試驗(yàn)結(jié)果的因素依次為葡萄糖＞硫酸銨＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀。對(duì)相關(guān)性分析可知，葡萄糖與磷酸二氫鉀的含量與試驗(yàn)結(jié)果呈正相關(guān)，硫酸銨和硫酸鎂的含量與試驗(yàn)結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。產(chǎn)朊假絲酵母菌的生物量會(huì)隨著葡萄糖與磷酸二氫鉀含量的增加而增多，后期試驗(yàn)可適當(dāng)多添加葡萄糖與磷酸二氫鉀含量。另一方面，由于硫酸鎂不添加不會(huì)對(duì)發(fā)酵體系造成影響，硫酸銨雖然需要添加，但其負(fù)方面影響十分微小，可以忽略其影響，在后期試驗(yàn)中可嘗試不添加此添加劑。

2.5 最佳配方重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

最佳配方重復(fù)實(shí)驗(yàn)做2組：依照1.1.4中的固體培養(yǎng)基制備方法，稱取9g麩皮和1g玉米粉，以此為底物，加入 0.5%硫酸銨，0.05%磷酸二氫鉀，6%葡萄糖，加入蒸餾水，制成 1∶1料液(加入菌液后料液比為 1∶1)，滅菌后接入 12%產(chǎn)朊假絲酵母菌液，30℃培養(yǎng)36h。

按照 2.4中酵母菌數(shù)的測(cè)定方法，對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母菌的菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定后，結(jié)果為 6.03×108個(gè)/g，與正交試驗(yàn)中第4組試驗(yàn)所獲得的酵母菌數(shù)量相近，即獲得的產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量仍最多。因此，此配方為最佳配方。

3 問(wèn)題與討論

3.1 避免菌體生長(zhǎng)不均

試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)不均一，其主要原因在于接種時(shí)沒(méi)有將培養(yǎng)基與菌種充分?jǐn)嚢杈鶆?，使?fàn)I養(yǎng)成分與菌液分布不均勻。在固體培養(yǎng)基中，酵母菌的活動(dòng)能力沒(méi)有在液體培養(yǎng)基中強(qiáng)，導(dǎo)致菌體在固體培養(yǎng)基中分布不均，不能充分利用營(yíng)養(yǎng)成分，菌體生長(zhǎng)受限，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。所以在接種時(shí)，一定要將菌種與培養(yǎng)基攪拌均勻，避免實(shí)驗(yàn)誤差出現(xiàn)。

3.2 接種量的選擇問(wèn)題

在接種量單因素試驗(yàn)時(shí)，最終選擇 12%為最優(yōu)結(jié)果。探討試驗(yàn)中，將接種量擴(kuò)大到 20%，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果與 12%的試驗(yàn)結(jié)果近似，考慮到節(jié)約成本問(wèn)題，沒(méi)有再次擴(kuò)大接種量，直接使用12%的接種量。

3.3 正交試驗(yàn)中各因素的選擇

葡萄糖是生物科學(xué)領(lǐng)域中分布廣泛且最重要的單糖，是大多活細(xì)胞的主要能量來(lái)源及代謝的中間產(chǎn)物，在產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞中能夠?yàn)槠涮峁┥顒?dòng)所需的能量。硫酸銨在酵母菌培養(yǎng)中，能為其提供適量無(wú)害的氮源。磷酸二氫鉀和硫酸鎂的主要作用是為給產(chǎn)朊假絲酵母提供可利用的鉀離子和鎂離子，在固體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，它們能使產(chǎn)朊假絲酵母菌在特定的環(huán)境下迅速生長(zhǎng)，提高菌種產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)主要是對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行固體發(fā)酵，以麩皮和玉米粉為底料，其比例為 9∶1，利用單因素試驗(yàn)(接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間)結(jié)果，為后續(xù)的正交試驗(yàn)提供相應(yīng)的基礎(chǔ)。根據(jù)正交試驗(yàn)得出，在固體底物中添加 0.5%硫酸銨，0.05%磷酸二氫鉀，6%葡萄糖，加入適量的蒸餾水，制成料液比 1∶1的發(fā)酵底物，再接入 12%的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)朊假絲酵母菌液，在 30℃培養(yǎng) 36h能得到較高的產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)量，在此條件下產(chǎn)朊假絲酵母能夠以最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)生長(zhǎng)。