陸海游，張 怡，童應凱，何煒璐，舒珊珊，張淇珊，牛家蕾

(天津農學院 農學與資源環(huán)境生物技術系 天津300384)

0 引 言

近年來，我國小麥年產量已超過 1億噸，加工后的麥麩每年可達 2000多萬噸，它是主要的農副產品資源之一[1]。由于麩皮容易獲得且成本較經濟，以麩皮和玉米粉為底料培養(yǎng)菌種生產生物飼料，在養(yǎng)殖業(yè)的實際應用中有重要意義。目前，用于微生物發(fā)酵生產蛋白質飼料的菌株主要是霉菌、酵母菌和細菌[2-3]。

本研究選用產朊假絲酵母為發(fā)酵菌種。有關研究表明：經過現代科學技術加工處理后，產朊假絲酵母菌可適用于現代新型功能食品的加工和食用[4]。在21世紀初，產朊假絲酵母在一些歐美國家的飼料工業(yè)中被廣泛用作優(yōu)良的飼料蛋白，或用于其他農作物材料，如稻草和油菜籽餅的發(fā)酵，并作為飼料蛋白質生產或者排毒[5]。目前其廣泛用于醫(yī)藥、食品工業(yè)和其他化妝品原料，并經 FDA批準可用于食品添加劑的安全酵母[6]。因此，利用產朊假絲酵母生產飼用添加劑或發(fā)酵劑具有良好的應用前景。

本研究旨在利用固體發(fā)酵方法，嘗試添加麩皮與玉米粉來優(yōu)化產朊假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，以提高其生產力并為單細胞蛋白的應用創(chuàng)造有利條件[7]，從而為新型的營養(yǎng)飼料提供一個良好的研究基礎理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

產朊假絲酵母：天津農學院農學與資源環(huán)境學院微生物實驗室保藏菌種。

1.1.2 種子液培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(%)：酵母膏1.0，蛋白胨2.0，葡萄糖2.0，pH值6.0，115℃滅菌20min。

1.1.3 種子液制備

將產朊假絲酵母菌接種于 YEPD液體培養(yǎng)基中，搖床30℃、180r/min培養(yǎng)20h。

1.1.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法

用 250mL三角瓶裝料 10g(9g麩皮+1g玉米粉)為底物，加入 0.5%硫酸銨、0.05%磷酸二氫鉀、9%葡萄糖，再加入一定量蒸餾水，攪拌均勻后115℃滅菌20min，然后接入種子液，30℃發(fā)酵。

硫酸銨溶液制備：將 2.5g硫酸銨溶于50mL蒸餾水中，固體培養(yǎng)基中添加1mL硫酸銨溶液。

磷酸二氫鉀溶液制備：將0.25g磷酸二氫鉀溶于50mL蒸餾水中，固體培養(yǎng)基中添加 1mL磷酸二氫鉀溶液。

葡萄糖溶液制備：將 11.25g葡萄糖溶于 50mL蒸餾水中，固體培養(yǎng)基中添加4mL葡萄糖溶液。

1.2 單因素試驗方法

1.2.1 接種量單因素試驗

利用上文1.1.4的方法，將接種量設為4%、8%、12%，分別加入7mL蒸餾水，形成1∶1.3的料液比，進行固體發(fā)酵 2d，然后測定產朊假絲酵母數量，得到固體發(fā)酵最佳接種量。

1.2.2 加水量單因素試驗

利用上文1.1.4的方法，采用1.2.1中確定的最佳接種量，將加水量設為 100%、150%、200%、250%，即料液比為 1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，固體發(fā)酵2d，用血球計數板進行計數，測定產朊假絲酵母數量，得到固體發(fā)酵中最佳加水量。

1.2.3 發(fā)酵時間單因素試驗

利用上文1.1.4的方法，采用1.2.1與1.2.2試驗結果，將發(fā)酵時間設定為 12、24、36、48、60h，發(fā)酵結束后分別測定產朊假絲酵母數量，從而確定最佳固體發(fā)酵時間。

1.3 正交試驗方法

1.3.1 對添加劑的正交試驗

以 9g麩皮和 1g玉米粉為底物，根據單因素試驗 1.2所得結果，對硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖4種添加劑進行L9(43)的正交試驗，確定其最佳固體發(fā)酵配方，正交表設計如表1和表2所示。

表1 正交試驗各因素所占百分比Tab.1 Percentage of each factor in orthogonal test

由于加入量較少，需將各因素配制成溶液以便添加：①將 5g硫酸銨加水定容至 50mL容量瓶中；②將0.05g硫酸鎂加水定容至50mL容量瓶中；③將0.5g磷酸二氫鉀加水定容至 50mL容量瓶中；④將20g葡萄糖加水定容至100mL容量瓶中。

表2 正交試驗處理Tab.2 Implementation table of orthogonal test

將表2所處理試劑分別加入刻度試管，置于以9g麩皮和 1g玉米粉為底物的固體培養(yǎng)基中，再加入蒸餾水(加水量為 1.2.2試驗結果)，充分攪拌，經過高壓滅菌后，進行接種(接種量為 1.2.1試驗結果)，攪拌均勻。接種完成后，將樣品放入 30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(培養(yǎng)時間為 1.2.3試驗結果)，測定菌種數量，根據極差分析法分析得到最佳試驗結果，選出最佳培養(yǎng)基配方。

1.3.2 正交驗證試驗

利用正交試驗所得最佳配方，進行重復驗證實驗，測得酵母菌數，確定最佳配方實驗的正確性。

1.4 產朊假絲酵母菌菌數測定方法

培養(yǎng)后樣品稱取 1g，倒入離心管，加入 20mL蒸餾水，振蕩離心約1min后，另取試管加入9mL蒸餾水及1mL離心液混勻，取100μL注入血球計數板凹槽，在光學顯微鏡下進行觀察計數。測菌數(稀釋倍數為200，樣品量為1g)，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 接種量試驗結果分析

通過設定不同接種量，探究接種量對于產朊假絲酵母固體發(fā)酵的影響。試驗結果如圖1所示。

圖1 接種量試驗結果Fig.1 Results of inoculation volume test

由圖1可知，在固體培養(yǎng)基中接種量為 4%時，產朊假絲酵母菌數量為 1.055×109個/g；接種量為8%時，酵母菌數為 1.085×109個/g；接種量為 12%時，酵母菌數最多，達 1.374×109個/g。分析數據發(fā)現，隨著接種量的增加，固體發(fā)酵體系中產朊假絲酵母數量增多。主要是由于菌種接種量越多，越容易在有限時間內快速達到菌種數量的最大值。但接種量不是越多越好，因為接種量過大，一是會造成不必要的浪費，二是會造成菌種間競爭關系，反而抑制固體發(fā)酵的有效進行。所以在后續(xù)正交試驗中，選取接種量為12%。

2.2 加水量試驗結果分析

通過設定不同加水量，探究加水量對于產朊假絲酵母固體發(fā)酵的影響。試驗結果如圖2所示。

由圖2可知，當固體發(fā)酵體系中料液比為 1∶1時，產朊假絲酵母菌數為 1.136×109個/g，獲得的酵母菌數最多；當料液比為 1∶1.5時，酵母菌數為1.074×109個/g；當料液比為 1∶2時，酵母菌數為1.048×109個/g；當料液比為 1∶2.5時，酵母菌數為1.055×109個/g。料液比與產朊假絲酵母菌數量的關系整體呈現先降低后升高的趨勢，但總體上看，后期趨勢變化不太明顯。說明料液比為 1∶1時，酵母菌能更好與固體發(fā)酵底物接觸，從而能達到更好的發(fā)酵效果；當加水量過多時，一方面會稀釋加入的微量元素，導致酵母菌吸收營養(yǎng)物質效率下降，另一方面加水量過大會造成發(fā)酵體系含氧量下降，影響酵母菌有氧代謝。因此在正交試驗中，選擇料液比為 1∶1，可以更好地進行麩皮固體發(fā)酵。

圖2 加水量試驗結果Fig.2 Results of water addition test

2.3 發(fā)酵時間試驗結果分析

通過設定不同的發(fā)酵時間，探究不同階段的發(fā)酵時間對于產朊假絲酵母固體發(fā)酵的影響。試驗結果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵時間試驗結果Fig.3 Results of fermentation time test

由圖3可知，在發(fā)酵經過12h時，產朊假絲酵母菌數為 1.91×108個/g，在發(fā)酵經過 24h時，酵母菌數為 6.36×108個/g；在發(fā)酵經過 36h時獲得的酵母菌數量最多，酵母菌數達到 1.304×109個/g；在 48h時，酵母菌數為 1.035×109個/g；在 60h時，酵母菌數為 1.095×109個/g。由于后期變化不太明顯，可以初步判斷發(fā)酵時間與產朊假絲酵母菌數量的關系整體呈現出先升高后降低的趨勢。通過分析數據發(fā)現，產朊假絲酵母菌在 36h時處于對數生長期，此時固體發(fā)酵體系營養(yǎng)物充足，菌種間暫時無競爭關系，菌種生長代謝極為活躍；隨著發(fā)酵時間的延長，營養(yǎng)物質被大量消耗，菌種間逐漸產生競爭關系，致使菌種數量逐漸下降。所以在后續(xù)的正交試驗中，選擇菌種發(fā)酵時間為正處于對數生長期的36h，作為產朊假絲酵母菌固體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)時間。

2.4 正交試驗結果分析

基于 2.1、2.2和 2.3的試驗結果，進行添加劑的正交試驗，測定產朊假絲酵母菌的數量后，通過極差分析選出最佳添加劑配方，結果如表3所示。

表3 正交試驗結果分析Tab.3 Analysis results of orthogonal test

根據表3中 K值可知，能獲得最多產朊假絲酵母菌生物量的配方是：0.5%硫酸銨，0.05%磷酸二氫鉀，6%葡萄糖，即 4號試驗為最佳配方組，所得的產朊假絲酵母菌生物量最高。通過R值的分析可知，影響正交試驗結果的因素依次為葡萄糖＞硫酸銨＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀。對相關性分析可知，葡萄糖與磷酸二氫鉀的含量與試驗結果呈正相關，硫酸銨和硫酸鎂的含量與試驗結果呈負相關。產朊假絲酵母菌的生物量會隨著葡萄糖與磷酸二氫鉀含量的增加而增多，后期試驗可適當多添加葡萄糖與磷酸二氫鉀含量。另一方面，由于硫酸鎂不添加不會對發(fā)酵體系造成影響，硫酸銨雖然需要添加，但其負方面影響十分微小，可以忽略其影響，在后期試驗中可嘗試不添加此添加劑。

2.5 最佳配方重復實驗結果驗證

最佳配方重復實驗做2組：依照1.1.4中的固體培養(yǎng)基制備方法，稱取9g麩皮和1g玉米粉，以此為底物，加入 0.5%硫酸銨，0.05%磷酸二氫鉀，6%葡萄糖，加入蒸餾水，制成 1∶1料液(加入菌液后料液比為 1∶1)，滅菌后接入 12%產朊假絲酵母菌液，30℃培養(yǎng)36h。

按照 2.4中酵母菌數的測定方法，對產朊假絲酵母菌的菌數進行測定后，結果為 6.03×108個/g，與正交試驗中第4組試驗所獲得的酵母菌數量相近，即獲得的產朊假絲酵母菌數量仍最多。因此，此配方為最佳配方。

3 問題與討論

3.1 避免菌體生長不均

試驗過程中，發(fā)現菌體生長不均一，其主要原因在于接種時沒有將培養(yǎng)基與菌種充分攪拌均勻，使營養(yǎng)成分與菌液分布不均勻。在固體培養(yǎng)基中，酵母菌的活動能力沒有在液體培養(yǎng)基中強，導致菌體在固體培養(yǎng)基中分布不均，不能充分利用營養(yǎng)成分，菌體生長受限，從而影響試驗結果。所以在接種時，一定要將菌種與培養(yǎng)基攪拌均勻，避免實驗誤差出現。

3.2 接種量的選擇問題

在接種量單因素試驗時，最終選擇 12%為最優(yōu)結果。探討試驗中，將接種量擴大到 20%，發(fā)現試驗結果與 12%的試驗結果近似，考慮到節(jié)約成本問題，沒有再次擴大接種量，直接使用12%的接種量。

3.3 正交試驗中各因素的選擇

葡萄糖是生物科學領域中分布廣泛且最重要的單糖，是大多活細胞的主要能量來源及代謝的中間產物，在產朊假絲酵母細胞中能夠為其提供生命活動所需的能量。硫酸銨在酵母菌培養(yǎng)中，能為其提供適量無害的氮源。磷酸二氫鉀和硫酸鎂的主要作用是為給產朊假絲酵母提供可利用的鉀離子和鎂離子，在固體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，它們能使產朊假絲酵母菌在特定的環(huán)境下迅速生長，提高菌種產量。

4 結 論

本試驗主要是對產朊假絲酵母進行固體發(fā)酵，以麩皮和玉米粉為底料，其比例為 9∶1，利用單因素試驗(接種量、料液比、發(fā)酵時間)結果，為后續(xù)的正交試驗提供相應的基礎。根據正交試驗得出，在固體底物中添加 0.5%硫酸銨，0.05%磷酸二氫鉀，6%葡萄糖，加入適量的蒸餾水，制成料液比 1∶1的發(fā)酵底物，再接入 12%的處于對數生長期的產朊假絲酵母菌液，在 30℃培養(yǎng) 36h能得到較高的產朊假絲酵母菌數量，在此條件下產朊假絲酵母能夠以最佳的生長狀態(tài)生長。