聶志巖，張 怡，王德慧，仇雅婷，桑珠普赤，張皓鈺，張乃楠，童應(yīng)凱

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系 天津300384)

0 引 言

目前世界衛(wèi)生組織制定了衡量整體肥胖的指標是體重指數(shù)(Body Mass Index，BMI)，即體重(kg)除以身高(m)的平方作為衡量肥胖的標準。以 BMI體重指數(shù)高于25kg/m2作為超重的判定條件。我國現(xiàn)階段的超重人數(shù)已達到了 2.1億，肥胖人數(shù)達到了9000萬人以上，并且該數(shù)據(jù)仍在不斷增長。許多人嗜食肥甘厚味，由于工作等原因缺乏運動，導(dǎo)致肥胖。本項目通過對有助于減肥降脂的食材和中草藥進行發(fā)酵研究，旨在研制能夠有效降低血脂、減輕體重的品質(zhì)優(yōu)良產(chǎn)品，從而幫助肥胖人群遠離疾病、增強體質(zhì)。此種產(chǎn)品具有調(diào)整腸道益生菌、促進脂肪分解、增加機體超氧化物歧化酶活性等功效，對于改善人們身體素質(zhì)有一定幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與菌種

原料：中藥店鋪出售的荷葉、山楂、絞股藍、決明子、葛根。

菌種：納豆芽孢桿菌(本實驗室保藏菌種)。

1.1.2 培養(yǎng)基

取固體粉末荷葉 4g、山楂 2g、絞股藍 1g、決明子 1g、葛根 1g，加蒸餾水 100mL于三角瓶中，包扎，滅菌；然后放置至室溫待培養(yǎng)基晾涼以后，進行接種發(fā)酵試驗。

中藥培養(yǎng)基(%)：荷葉 4.0，山楂 2.0，絞股藍1.0，決明子 1.0，葛根 1.0，121℃滅菌 20min。

1.2 試驗方法

取適量固體荷葉、山楂、絞股藍、決明子、葛根，放入烘箱中 70℃烘干 3～4h，取出置于粉碎機內(nèi)粉碎約 3min，然后裝入密封袋中置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 測定方法

2.1 感官分析

觀察發(fā)酵飲品的外觀顏色、氣味以及味道，按照表1進行評分，選出酶活性較高且感官評價綜合得分較高者。

表1 感官評價Tab.1 Sensory evaluation table

2.2 正交試驗方法

按照表2條件(接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、加糖量)對中藥進行不同處理，經(jīng)過培養(yǎng)以后，分別測定脂肪酶和超氧化物歧化酶活性，根據(jù)極差分析法分析得到最佳試驗結(jié)果，選出最優(yōu)的處理條件。

表2 正交試驗處理Tab.2 Implementation table of orthogonal test

2.3 脂肪酶活性測定

銅皂法原理：利用脂肪酶將橄欖油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和顯色劑中的銅離子反應(yīng)生成銅皂藍色鉻合物，在710nm 波長下有最大吸收值，再對照脂肪酸吸光度工作曲線得出脂肪酸的濃度并計算酶的活性[1]。酶的活力單位(IU)定義為在測定條件下每分鐘水解產(chǎn)生1μmol游離脂肪酸所用的脂肪酶量[2]。

標準曲線繪制：取濃度為 2、4、6、8、10mmol/L的油酸溶液各 4mL，分別加入 1mL乙酸銅顯色劑，置于 37℃、150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩2min，空白對照用 4mL蒸餾水代替油酸，其他操作步驟相同，振蕩后置于高速離心機中 4000r/min離心 10min，取上層有機相在紫外分光光度計 710nm下測吸光度，以吸光度對油酸濃度作圖，即可繪制出標準曲線(圖1)。

試驗中分別以 75%乙醇、無水乙醇及正己烷作為油酸溶液的溶劑，試驗后只有正己烷可以與其很好的相容，其余均出現(xiàn)不同程度的分層現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗不能正常進行，因此選用正己烷作溶劑對油酸進行稀釋來進行試驗[3]。

圖1 脂肪酶標準曲線Fig.1 Standard curve of lipase

發(fā)酵液脂肪酶測定方法：取pH值為7.5的3mL磷酸緩沖液加入 1mL橄欖油，置于 37℃、150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩 10min，加入 1mL發(fā)酵液，置于 37℃、150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩2min[4]，取出后加入 8mL苯或者甲苯溶液，置于高速離心機中 4000r/min離心 10min，取上層有機相8mL置于一支新的離心管中，加入2mL乙酸銅顯色劑，置于 37℃、150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩2min，然后于高速離心機中4000r/min離心10min，取上層有機相在紫外分光光度計710nm下測吸光度。

式中：c——脂肪酸濃度；V1——脂肪酸溶液體積；t——作用時間；V2——消耗發(fā)酵液體積。

2.4 超氧化物歧化酶活性測定

鄰苯三酚方法原理：鄰苯三酚也稱焦性沒食子酸，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，但在弱堿性環(huán)境中會發(fā)生自氧化反應(yīng)，它在自氧化時只接受一個電子生成超氧陰離子自由基，并在其自氧化過程中以一定速率生成有色中間物，SOD可以將氧負離子歧化分解成過氧化氫和氧氣，從而抑制鄰苯三酚的自氧化速率。每分鐘反應(yīng)液中 SOD抑制其 50%時，反應(yīng)速率即為 SOD活力單位[5]。以 tris-HC1緩沖液為對照進行調(diào)零后在 420nm 下測吸光度，根據(jù)抑制率判斷樣品對氧負離子清除的能力。每份樣品重復(fù)測定3次。

超氧化物歧化酶活力計算：

式中：V1——反應(yīng)液總體積；V2——測定樣品體積；n——樣品稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 感官分析

感官評價結(jié)果見表3。

表3 感官評價結(jié)果Tab.3 Sensory evaluation results

3.2 中藥飲品發(fā)酵正交實驗結(jié)果

由于本實驗以脂肪酶活性高、過氧化物歧化酶活性高為最終目標，觀測指標以脂肪酶活性和過氧化物歧化酶活性為主。正交試驗中加糖是為了調(diào)節(jié)該飲品口感并可促進菌生長發(fā)酵，故考慮接種量、時間、溫度、加糖量 4個因素的影響。脂肪酶活性、過氧化物歧化酶活性測定數(shù)據(jù)如表4所示。

各個因素的離差平方和(Si)反映了各因素對試驗結(jié)果的影響，由表 4可知，對于脂肪酶活力而言，SA=1.9917，SB=1.0331，SC=0.84420，SD=0.4108，SA＞SB＞SC＞SD。就超氧化物歧化酶活性而言，SA=1200，SB=104，SC=11421，SD=587，SC＞SA＞SD＞SB。對于脂肪酶而言接種量影響最大，而對于 SOD酶而言，發(fā)酵時間影響最大。因此要獲得脂肪酶活性高的中藥飲品可適當加大接種量，要獲得 SOD活性高的中藥飲品可適當增加發(fā)酵時間，即可大幅提升酶活性。對于因素D，因中藥有特殊氣味，加糖量為4%時，口感較好，可滿足大多數(shù)人的口感。

表4 中藥飲品發(fā)酵正交實驗結(jié)果Tab.4 Orthogonal experimental results of fermentation of traditional Chinese medicine drink

3.3 脂肪酶活性分析

由表5可以看出，對脂肪酶活性影響最大的因素為接種量，影響最小的因素為加糖量。

表5 脂肪酶活性方差分析表Tab.5 Lipase activity variance analysis table

由表6可以看出，對超氧化物歧化酶活性影響最大的因素為發(fā)酵時間，影響最小的因素為發(fā)酵溫度。

表6 超氧化物歧化酶活性方差分析表Tab.6 Superoxide dismutase activity variance analysis table

取臨界值F0.05和F0.10之間作為顯著性判斷標準：就脂肪酶活力而言，F(xiàn)1=3.0135，F(xiàn)0.05=19.0，F(xiàn)0.10=9.0，F(xiàn)0.05＞F0.10＞F1；就超氧化物歧化酶活力而言，F(xiàn)2=0.4192，F(xiàn)0.05=1 9.0，F(xiàn)0.10=9.0，F(xiàn)0.05＞F0.10＞F2。這表明，培養(yǎng)條件為 A3、B2、C1、D3時脂肪酶和超氧化物歧化酶活性均為最高值，綜合感官評價，加糖量為4%時的口感較為適中。

4 問題與討論

4.1 避免測定脂肪酶反應(yīng)液不分層

試驗中分別以 75%乙醇、無水乙醇及正己烷作為油酸溶液的溶劑，試驗后只有正己烷可以與其很好相容，其余均出現(xiàn)不同程度的分層現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗后續(xù)測定不能正常進行，因此選用正己烷作溶劑對油酸進行稀釋來進行試驗。

4.2 乙酸銅配置

取 5%的乙酸銅固體溶解于 100mL蒸餾水中，用吡啶調(diào)節(jié) pH值至 6.1。使用之前一定要進行過濾操作，否則會有不溶性物質(zhì)沉淀影響吸光度測定值。

4.3 測定酶活性準時終止反應(yīng)

測定脂肪酶活性以及超氧化物歧化酶活性時，一定要準時終止反應(yīng)，避免反應(yīng)時間相差很大，造成較大誤差。

4.4 正交試驗中各因素的選擇

發(fā)酵溫度、時間、接種量、加糖量都對納豆芽孢桿菌在培養(yǎng)基上生長有不同程度的影響。葡萄糖是生物科學(xué)領(lǐng)域中分布廣泛且最重要的單糖，是大多活細胞的主要能量來源及代謝的中間產(chǎn)物，在產(chǎn)納豆芽孢桿菌中能夠為其提供生命活動所需的能量，促進納豆芽孢桿菌的增殖。

5 結(jié) 論

綜合正交實驗結(jié)果分析以及感官評價，可以得出最佳工藝條件為：中藥烘干 4h，粉碎 3min，荷葉4g，山楂 2g，絞股藍 1g，決明子 1g，葛根 1g，水100mL，接種量 0.6%，溫度 40℃，發(fā)酵時間 14h，加糖量4%。