鄧子亮 陳瓊香 郭洪勝 鄭采婷 李婉怡 周雅賢 梁艷君 王森 王焱2，（通訊作者）

（1 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣東 東莞 523808）

（2 廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣東 東莞 523808）

（3 東莞常安醫(yī)院心血管內(nèi)科 廣東 東莞 523000）

在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生中，炎癥反應(yīng)及單核/巨噬細(xì)胞分泌的大量炎癥因子發(fā)揮重要作用[1]。巨噬細(xì)胞吞噬膽固醇后，轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致溶酶體破壞，并釋放炎癥因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和活化，加劇AS的發(fā)生。中藥制劑腦心通（naoxintong，NXT）廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病和缺血性疾病，具有抗凝、抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮、改善微循環(huán)、穩(wěn)定斑塊等作用[2]，還可增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫力及清除自由基[3]，在AS的防治中具有較好的應(yīng)用前景。人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞在白血病、AS等疾病研究中均有應(yīng)用，本課題組就NXT對(duì)THP-1細(xì)胞活力的影響及其作用特點(diǎn)展開實(shí)驗(yàn)研究，為進(jìn)一步研究腦心通防治AS，開發(fā)傳統(tǒng)中藥NXT的新用途提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.資料與方法

1.1 材料與儀器

THP-1細(xì)胞由廣東醫(yī)科大學(xué)生化教研室張志珍教授贈(zèng)送；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，11875）、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，10270）；腦心通（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司）； CCK8（日本同仁化學(xué)研究所，LH646）；DMSO（D8370），離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，TGL-16 L400）、Thermofisher 160i二氧化碳培養(yǎng)箱、BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀、寧波舜宇XD30倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺(tái)、廣州諾爾路生物科技有限公司MX-RD-E混勻器。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng) THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640。每 2～3d傳代1次，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 腦心通藥物稀釋液的制備 將腦心通膠囊中的粉末稱重，按照0.1g/ml的質(zhì)量體積比加入DMSO或無水乙醇（EtOH），室溫下于混勻器搖動(dòng)浸取12h。2500rpm離心20min，取其上清為原液，分裝-20℃保存。用無血清培養(yǎng)基倍比稀釋成工作濃度（確保使用終濃度中的DMSO不超過1/1000）。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞，以每孔2×l04個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。各組設(shè)3復(fù)孔，按如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育后，每孔加入10μl CCK8試劑，37℃避光反應(yīng)2～3h后，450nm波長(zhǎng)（參比630nm）檢測(cè)每孔的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=[（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對(duì)照孔-A空白孔）]×100%。

1.2.4 不同溶劑對(duì)細(xì)胞活力影響實(shí)驗(yàn) 設(shè)空白組：只含培養(yǎng)基無細(xì)胞和藥物、DMSO對(duì)照組（Negative）：1/1000（終濃度，下同）的DMSO、DMSO實(shí)驗(yàn)組（NXT）：1/1000的NXTDMSO浸取液、EtOH對(duì)照組（Negative）：1/1000EtOH和EtOH實(shí)驗(yàn)組(NXT)：1/1000的NXT-EtOH浸取液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h后檢測(cè)。不同稀釋度的NXT對(duì)細(xì)胞活力影響實(shí)驗(yàn)設(shè)DMSO對(duì)照組（0）：DMSO 1/1000，實(shí)驗(yàn)組：NXT浸取液作用細(xì)胞的稀釋度分別為1/100，1/1000和1/10000，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h后檢測(cè)。

NXT不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力影響實(shí)驗(yàn) 設(shè)DMSO對(duì)照組（0）：DMSO 1/1000，實(shí)驗(yàn)組：NXT浸取液作用細(xì)胞的稀釋度為1/1000，分別作用1h、4h、8h和12h后檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組組間差異用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 NXT的不同溶劑浸取液的作用效果

CCK8法檢測(cè)終濃度為1/1000的NXT浸取液對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示(Fig 1）：與溶劑對(duì)照（Negative）組比較，NXTDMSO浸取液可顯著提高細(xì)胞活性至115.84%±3.22%（P=0.023）,而NXT-EtOH 浸取液對(duì)細(xì)胞活力的提高沒有顯著效果。

2.2 NXT提高THP-1細(xì)胞活力的劑量效應(yīng)

將不同的終濃度的NXT-DMSO浸取液作用于細(xì)胞3小時(shí)后，可觀察到(Fig 2）：和溶劑組（0組）相比較，1/10000稀釋的NXT對(duì)細(xì)胞活力的提高作用有限，終濃度1/1000的藥物提高細(xì)胞活力的效果最佳（P＜0.05）；繼續(xù)增加藥物濃度，可觀察到細(xì)胞活性迅速降低，1/100稀釋的藥物組的細(xì)胞活力僅為48.19%±7.29%（P＜0.001）。

2.3 NXT提高THP-1細(xì)胞活力的時(shí)間效應(yīng)

將終濃度為1/1000的NXT-DMSO浸取液作用細(xì)胞不同時(shí)間后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果(Fig 3）：和溶劑組（0）相比較，NXT作用1h即可有效提高THP-1細(xì)胞活力（P＜0.01），作用4h效果最佳（P＜0.001），藥效可持續(xù)到接近8h（P=0.058）。

Fig 1 NXT的不同溶劑浸取液對(duì)THP-1細(xì)胞活力的提高作用比較（P為NXT組與對(duì)照（Negative）組比較的t檢驗(yàn)結(jié)果，n=3）。

Fig 2 不同稀釋度的NXT對(duì)THP-1細(xì)胞活力的提高作用比較（NXT組與對(duì)照（0）組比較，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001，n=3）。

Fig 3 NXT做用不同時(shí)間對(duì)THP-1細(xì)胞活力的提高作用比較（NXT組與對(duì)照（0）組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3）

3.討論

AS是一種由多因素共同作用引起的全身性疾病，動(dòng)脈脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)纖維化等因素促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。單核細(xì)胞受到CCR2/ MCP-1等多種趨化因子募集遷移，黏附到活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，浸潤(rùn)到內(nèi)膜下層，可轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞。同時(shí)垂體前葉及外周單核巨噬細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）在AS發(fā)生中也起到重要作用[4]。MIF可抑制巨噬細(xì)胞的游走，同時(shí)促進(jìn)其局部浸潤(rùn)、活化及分泌炎癥因子促進(jìn)AS發(fā)生。巨噬細(xì)胞吞噬膽固醇等脂質(zhì)后，轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)AS斑塊的形成[5]。

腦心通是“腦心同治”理論的代表性現(xiàn)代中藥方劑，由黃芪66g，赤芍27g，丹參27g，當(dāng)歸27g，川芎27g，桃仁27g，紅花13g，醋乳香13g，醋沒藥13g，雞血藤20g，牛膝27g，桂枝20g，桑枝27g，地龍27g，全蝎13g，水蛭27g共16味中藥組成[6]。臨床上，腦心通具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的作用，主要用于治療冠心病、心絞痛、腦卒中等心腦血管疾病。近年隨著國(guó)家對(duì)大力推進(jìn)中醫(yī)藥繼承與創(chuàng)新，腦心通的二次開發(fā)取得明顯進(jìn)展：其在治療糖尿病慢性并發(fā)癥、原發(fā)性高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化以及腰椎間盤突出等癥等方面都有較好的效果[7]。

本結(jié)果顯示，腦心通可提高單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞的活力，對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，與劉倩等人的研究結(jié)果一致[8]。腦心通中的黃芪多糖能抑制THP-1細(xì)胞分泌TNF-α，減緩巨噬-泡沫細(xì)胞的形成[9]；川芎有擴(kuò)張血管、抑制炎癥反應(yīng)的作用[10]；丹參有降脂、抗炎等多種作用[11]。這提示我們腦心通可能通過抑制炎癥因子分泌，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)單核細(xì)胞的活力有一定的保護(hù)作用，這也與腦心通通過抗炎來減緩動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制相一致。今后，我們將就腦心通的抗炎效應(yīng)在AS發(fā)生中的作用展開深入研究。

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，腦心通在1h就能基本達(dá)到最佳藥效，有效作用時(shí)間接近8h，顯示出較其有效成分吸收迅速，有效時(shí)間窗較寬。結(jié)果表明，1/100稀釋的腦心通浸取液對(duì)細(xì)胞活性表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，這提示高濃度的腦心通對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，與李偉霞等論文[7]顯示腦心通可引起一定的惡心、嘔吐等不良反應(yīng)相一致。

綜上所述，結(jié)果顯示出腦心通對(duì)單核細(xì)胞系的保護(hù)作用及其作用規(guī)律，為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。也提示，盡管傳統(tǒng)方藥腦心通已經(jīng)在臨床尚廣泛應(yīng)用，其藥理機(jī)制、作用機(jī)理及新的用途尚需更深入的研究。