錢(qián) 程，楊青楠，丁麗玉，王浣清，張 丹，吳 飛?，馮 怡?

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院藥劑科，上海 200040；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥研究院，中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200437；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200437）

芪貞降糖方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院用于治療2 型糖尿病或糖調(diào)節(jié)異常的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、女貞子（制）、靈芝和烏梅（制）4 味中藥組成，在改善患者胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖代謝等方面療效顯著［1-4］。本課題組前期［5-7］系統(tǒng)開(kāi)展了醫(yī)院制劑芪貞降糖顆粒的藥學(xué)研究，建立了定性和定量的質(zhì)量控制方法，但尚欠缺對(duì)制劑進(jìn)行整體質(zhì)量控制的手段。多靶點(diǎn)、多組分是中藥制劑獨(dú)有的特點(diǎn)，當(dāng)今對(duì)于中藥制劑的質(zhì)量控制正越來(lái)越多地采用藥材與制劑特征圖譜譜峰相結(jié)合的方法［8-10］。本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法建立芪貞降糖顆粒的特征圖譜，通過(guò)指認(rèn)圖譜中的指標(biāo)性成分，比對(duì)芪貞降糖顆粒的特征圖譜與組方單味藥材的特征圖譜主要色譜峰的保留時(shí)間，得到專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的特征指標(biāo)。通過(guò)本研究所建立的特征圖譜，可進(jìn)一步對(duì)顆粒與臨床用芪貞降糖方湯劑進(jìn)行物質(zhì)一致性初步評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 型 HPLC 色譜儀（DAD 檢測(cè)器，美國(guó) Agilent 公司）；XP205 型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多科技有限公司）；SQP 型電子天平（0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；B-491 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi 科學(xué)儀器有限公司）；TGL-18C 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SK7210HP 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲設(shè)備有限公司）；YM-300D 型電子煎藥壺（廣東益美生活電器有限公司）；F2 型移液槍（美國(guó) Thermo Scientific 公司）；Milli-Q 型超純水機(jī)（密理博中國(guó)科技有限公司）；玻璃儀器均購(gòu)自上海青陽(yáng)生物科技有限公司。

烏梅（制）（批號(hào) 150826，浙江）、靈芝（批號(hào)151201，山東）、黃芪（批號(hào) 151112，甘肅）、女貞子（制）（批號(hào)151017，湖南）均購(gòu)自上海康橋藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心徐紅研究員鑒定為正品。特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)111926-201404）、枸櫞酸對(duì)照品（批號(hào)100396-201302）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)111920-201102）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。3 批芪貞降糖顆粒中試產(chǎn)品（批號(hào)分別為1606001、1606002、1606003，20 g／袋，上海寶龍藥業(yè)有限公司加工）。水為超純水；甲醇、磷酸等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取特女貞苷、枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容，即得，三者稀釋后質(zhì)量濃度分別為0.110 4、0.539 0、0.051 6 mg／mL。

2.1.2 芪貞降糖顆粒溶液 稱取顆粒4 g（相當(dāng)于1 d 服用量的 10%），加水定容至100 mL，超聲（350 W、53 kHz）30 min，18 000 r／min 離心 10 min，取上清液，即得。

2.1.3 芪貞降糖方湯劑 按芪貞降糖方組成（1 d 處方量）稱取黃芪 12 g、女貞子（制）12 g、靈芝 15 g、烏梅（制）15 g，加水 500 mL 浸泡 15 min，煎煮 2 次，每次30 min，將 2 次濾液合并，定容至 1 000 mL，移取溶液，18 000 r／min 離心 10 min，取上清液，即得。

2.1.4 藥材溶液 分別取芪貞降糖方中對(duì)應(yīng)的各單味藥材飲片，按其在處方中對(duì)應(yīng)的處方量取樣，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。同法制備各藥材飲片的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件［11-12］ZORBAX SB-Aq Stablebond Analytical色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相 0.1% 磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，0B；10～90 min，0～65% B）；進(jìn)樣量 10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 224 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫 30 ℃。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取顆粒（1606003）制備的供試品溶液，于 0、2、4、6、12、24 h 在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以特女貞苷色譜峰為參照峰（S），得到各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD≤ 0.24%，相對(duì)峰面積RSD≤1.35%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取顆粒（1606003）制備的供試品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，以特女貞苷色譜峰為參照峰（S），測(cè)得各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.18%，相對(duì)峰面積的 RSD 值≤0.74%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重 復(fù)性試驗(yàn)取顆粒（1606003）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以特女貞苷色譜峰為參照峰（S），得到各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD ≤0.20%，相對(duì)峰面積的RSD≤1.69%，表明該法重復(fù)性良好。

2.3.4 專屬性考察 取顆粒（批號(hào)1606003）、4 個(gè)單味藥材及4 個(gè)對(duì)應(yīng)的陰性樣品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，用 DAD 檢測(cè)器獲取并保存3D 圖譜，取224 nm 波長(zhǎng)處的譜圖。4 個(gè)單味藥材色譜圖中均能找到與顆粒劑色譜圖中保留時(shí)間一致的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 特征圖譜建立［11-12］取3批顆粒（1606001～1606003）供試品溶液以及對(duì)照品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，應(yīng)用 “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件將3 批樣品的色譜圖導(dǎo)入軟件，依次設(shè)定參照?qǐng)D譜、色譜峰校正、色譜峰匹配，得到對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖1。在3 批樣品中有 27 個(gè)共有峰，對(duì)比樣品色譜圖與對(duì)照品色譜圖中各峰的保留時(shí)間，可指認(rèn)其中3 個(gè)，分別為枸櫞酸（2 號(hào)峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（20號(hào)峰）、特女貞苷（21 號(hào)峰）。各樣品間的相似度大于0.998，與對(duì)照?qǐng)D譜間的相似度分別為 0.999、0.999、0.999。因此，由整體譜峰信息可知 3 批樣品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.5 制劑與湯劑譜峰匹配 取 “2.1.3”項(xiàng)下樣品溶液，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄 90 min 內(nèi)色譜圖，并與顆粒特征圖譜進(jìn)行疊加，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，樣品與顆粒特征圖譜27 個(gè)色譜峰保留時(shí)間能逐一對(duì)應(yīng)，兩者相似度為0.906，表明顆粒與臨床用湯劑所含物質(zhì)基本一致。

圖2 芪貞降糖顆粒與芪貞降糖方湯劑譜峰匹配圖

2.6 制劑與藥材譜峰匹配 在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定“2.1.4”項(xiàng)藥材溶液，記錄90 min 內(nèi)色譜圖，并與顆粒特征圖譜進(jìn)行疊加，見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，各單味藥材貢獻(xiàn)的譜峰分別為黃芪 6 個(gè)（1、3、4、14、20、25 號(hào)峰）、女貞子 12 個(gè)（1、3、5、8、9、10、11、13、17、21、22、26號(hào)峰）、靈芝 2 個(gè)（4、27 號(hào)峰）、烏梅（制）3 個(gè)（2、6、11 號(hào)峰），其中 1、3 號(hào)峰為黃芪和女貞子（制）共有，4號(hào)峰為靈芝和黃芪共有，11 號(hào)峰為女貞子（制）和烏梅（制）共有。各單味藥材中的色譜峰大多數(shù)能與顆粒特征圖譜對(duì)應(yīng)，關(guān)聯(lián)性良好，但顆粒特征圖譜中大部分色譜峰都高于單味藥材中，這可能與特征圖譜中藥材的疊加作用，以及制劑過(guò)程中的多組分助溶作用相關(guān)。

圖3 芪貞降糖顆粒與4 味藥材飲片譜峰匹配圖

3 討論

3.1 譜峰匹配特征圖譜 本課題組采用譜峰匹配特征圖譜手段對(duì)芪貞降糖顆粒開(kāi)展研究，對(duì)顆粒特征圖譜中的色譜-光譜可視化成分進(jìn)行了來(lái)源辨析和歸屬，以期為制劑的進(jìn)一步綜合質(zhì)量控制，最終為保證產(chǎn)品的臨床療效奠定基礎(chǔ)。

3.2 特征圖譜的應(yīng)用 中藥特征譜技術(shù)［13-15］是目前應(yīng)用比較廣泛且較受認(rèn)同的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)一致性評(píng)價(jià)技術(shù)，在建立芪貞降糖顆粒的HPLC 特征譜的基礎(chǔ)上，將中試加工的芪貞降糖顆粒與湯劑進(jìn)行比較，從化學(xué)特征譜角度評(píng)價(jià)顆粒在制劑工藝條件下的加工產(chǎn)品與原湯劑組成一致性。

3.3 相似度評(píng)價(jià)［13-15］本研究通過(guò)HPLC 建立的3 批次芪貞降糖顆粒的特征圖譜能夠綜合、全面地反映顆粒及顆粒中各單味藥材所含化學(xué)組分。不同批次樣品間相似度均高于0.998，體現(xiàn)了在制劑過(guò)程對(duì)顆粒及顆粒中各單味藥材所含的化學(xué)組分影響較小，制劑組分整體穩(wěn)定。

3.4 色譜條件優(yōu)化 分別考察了 260、224、210 nm 下得到的色譜，結(jié)果表明在224 nm 下色譜圖基線平穩(wěn)、分離度較好、色譜峰最多、峰面積均衡，故選取224 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。其次對(duì)分離條件進(jìn)行了考察，篩選了甲醇-水、0.2%冰醋酸-甲醇、0.1%磷酸-甲醇3種流動(dòng)相，結(jié)果表明0.1%磷酸-甲醇梯度洗脫譜峰信息較多，分離度較好。本研究建立了芪貞降糖顆粒HPLC-DAD 特征圖譜，出峰數(shù)目、強(qiáng)度及共有峰等評(píng)價(jià)信息較好，可整體反應(yīng)顆粒的物質(zhì)相關(guān)特征信息。同時(shí)，結(jié)合芪貞降糖顆粒與組方單味藥材特征圖譜的譜峰匹配研究及指認(rèn)特征峰等檢測(cè)手段［16-17］，初步明確了芪貞降糖顆粒組分來(lái)源歸屬，使質(zhì)控結(jié)果更趨合理，可更全面綜合地控制制劑質(zhì)量，但還需含有量測(cè)定、結(jié)構(gòu)鑒定等相關(guān)研究作進(jìn)一步驗(yàn)證。