徐加杰 葛明華 鄭國(guó)灣 王林紅 郭海魏 鄭傳銘

烏骨藤，又名通光散，具有消炎鎮(zhèn)痛、止咳平喘、抗腫瘤的功效[1]。由烏骨藤提取物制備的消癌平已作為治療消化道癌的一線藥物廣泛應(yīng)用于臨床。藥理研究發(fā)現(xiàn)，烏骨藤中主要化學(xué)成分C21甾體苷對(duì)多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用，C21甾體苷廣泛存在于蘿藦科植物中，有誘導(dǎo)和促使微管蛋白聚合、微管裝配與微管穩(wěn)定的獨(dú)特作用機(jī)制，從而徹底鏟除腫瘤細(xì)胞有絲分裂的原生動(dòng)力[2]。C21甾體苷能對(duì)肝癌荷瘤小鼠起到抑制腫瘤增長(zhǎng)和提高荷瘤小鼠免疫保護(hù)的功能，還能誘導(dǎo)癌細(xì)胞G1期阻滯，上調(diào)促凋亡基因caspase-3、caspase-9和Bax的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[3-4]。唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）為常見(jiàn)的唾液腺惡性腫瘤，約占全部唾液腺惡性腫瘤的21%～24%[5]。目前主要的治療手段為手術(shù)治療輔以放化療的綜合治療策略，但SACC具有侵襲性強(qiáng)且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)治療的SACC患者在短暫無(wú)病生存期后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較為多見(jiàn)，且一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，SACC患者中位生存期僅為3年，為臨床治療帶來(lái)極大的困難[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立SACC移植瘤模型裸鼠，探討烏骨藤有效成分C21甾體苷對(duì)SACC的抗腫瘤作用及其在腫瘤增殖、凋亡過(guò)程中的分子機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與瘤株 BALB/C裸鼠24只，4周齡，由上海斯萊克公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0021。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度 22±2℃，濕度 50%～60%，光照每12h明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。細(xì)胞株：涎腺腺樣囊性癌的低侵襲細(xì)胞株（SACC-83）和肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（SACC-LM）由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 藥品與試劑器材 烏骨藤C21甾體苷提取物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠中藥炮制研究中心提供（批號(hào)20171229）；DMEM高糖培養(yǎng)基：Hyclone公司（批號(hào)AD17497268）；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司（批號(hào)18040504）；Trypsin 0.25%（1×）：Solution Hyclone公司（批號(hào) J1800038015）；SYBR Green qPCR試劑盒：康為世紀(jì)（批號(hào)CW2601）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：康為世紀(jì)（批號(hào)CW2569）；RIPA裂解液：碧云天（批號(hào)P0013D）；BCA蛋白定量試劑盒：Solarbio 公司（批號(hào) pc0020）；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9抗體：Affinity公司（批號(hào) AF6139）。游標(biāo)卡尺（上海SANTO公司）；Mastercycler PCR儀（Eppendorf公司）；核酸定量?jī)x（Thermo Scientific公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-red公司）；CMaxPius酶標(biāo)儀（SpectiaMax公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥 取24只裸鼠，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SACC-83及SACC-LM細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，每只裸鼠頸部右側(cè)皮下接種0.2mL，繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，2～3周后供實(shí)驗(yàn)用。待腫瘤增殖至可以觸及時(shí)，將小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，每組6只。SACC-83模型組（生理鹽水）高分化細(xì)胞；SACC-83 C21甾體苷組（C21甾體苷，10mg/kg）；SACC-LM模型組（生理鹽水）低分化細(xì)胞；SACC-LM C21甾體苷組（C21甾體苷，10mg/kg）。每日腹腔注射 1次，連續(xù)注射4周，30天后取材。

2.2 抑瘤率及體征觀察 待腫瘤長(zhǎng)出后，測(cè)量生長(zhǎng)腫瘤的瘤塊長(zhǎng)徑（L）和橫徑（W），單位為毫米（mm）。腫瘤體積=（L×W2）/2，腫瘤增長(zhǎng)率=[（B-A）/A]×100%。（A：為開始用藥時(shí)腫瘤體積，B：為處死時(shí)腫瘤體積）同時(shí)每日觀察記錄裸鼠精神、活動(dòng)、進(jìn)食等情況。

2.3 HE染色 采用HE染色觀察各組裸鼠病理學(xué)改變。取給藥30天后的各組裸鼠腫瘤、癌旁組織和肺組織，于10%甲醛中固定，洗滌脫水后浸蠟包埋制備病理切片，蘇木素和伊紅染色染色后封片，于200倍光鏡下觀察各組裸鼠組織病理變化。

2.4 Western blot檢測(cè)瘤體組織 Bcl-2、Bax、Casp-3蛋白表達(dá) 瘤體組織（每200mg加1mL 0.9%生理鹽水）RIPA裂解液后手動(dòng)勻漿器研磨。置于冰上裂解30min；12000rpm離心 5min，取上清。酶標(biāo)儀A562nm波長(zhǎng)測(cè)定組織的總蛋白濃度。配制5%濃度的SDS-PAGE濃縮膠，加入適量蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)后在暗室中用X膠片顯影，以GAPDH作內(nèi)參，用圖像分析軟件Image J進(jìn)行各組條帶灰度測(cè)定。

2.5 qPCR檢測(cè)瘤體組織Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA水平 將瘤體組織（每200mg加1mL0.9%生理鹽水）放入Trizol的勻漿管中，將裂解后樣品室溫放置5～10min，使得核蛋白與核酸完全分離，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為 42℃，15min；85℃，5min。隨后進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃，10min變性；95℃，15s；60℃，60s；40次循環(huán)。用△△Ct法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的 LSD 法（最小顯著性法），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 烏骨藤C21甾體苷抑瘤率檢測(cè)結(jié)果 連續(xù)注射給藥C21甾體苷4周后，與SACC-83模型組比較，SACC-83 C21甾體苷組腫瘤終體積顯著下降（P＜0.05），且抑瘤率達(dá)26.8%；與SACC-LM模型組比較，SACC-LM C21甾體苷組的腫瘤終體積顯著下降（P＜0.05），抑瘤率為 24.8%。見(jiàn)表1，插頁(yè)圖1。

圖1 各組裸鼠腫瘤大小

圖2 各組裸鼠腫瘤、癌旁組織和肺組織HE染色結(jié)果（×200）

圖3 Western blot檢測(cè)C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白表達(dá)的影響

表1 各組裸鼠腫瘤終體積及抑瘤率（±s）

表1 各組裸鼠腫瘤終體積及抑瘤率（±s）

注：與各自模型組比較，*P＜0.05

鼠數(shù) 腫瘤終體積（mm3） 抑瘤率（%）組別SACC-83模型組SACC-83 C21甾體苷組SACC-LM模型組SACC-LM C21甾體苷組6 6 6 6 317.7±58.6 232.6±32.8*394.1±28.9 296.5±38.8*26.8 24.8

3.2 荷瘤裸鼠HE染色形態(tài)學(xué)變化 各組裸鼠腫瘤、癌旁組織和肺組織HE染色結(jié)果如插頁(yè)圖2所示。腫瘤組織HE染色顯示，SACC-83模型組和SACC-LM模型組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞核大且染色深，壞死范圍較?。籗ACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組藥物治療后的細(xì)胞數(shù)量較模型組均有所減少，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，壞死面積較多。癌旁組織HE染色可見(jiàn)SACC-83模型組和SACC-LM模型組癌旁組織細(xì)胞排列松散，大小不一，胞漿豐富紅染，有炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象；SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組的細(xì)胞排列規(guī)則緊密，細(xì)胞數(shù)目增多，炎癥浸潤(rùn)減弱。肺組織HE染色可見(jiàn)SACC-83模型組和SACC-LM模型組的肺組織可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，細(xì)胞存在一定損傷，肺水腫且肺泡壁增厚；SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組的肺損傷程度減輕，可見(jiàn)較少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移發(fā)生。

3.3 C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)的影響 與對(duì)于Bcl-2蛋白水平，SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組的Bcl-2蛋白水平與各自模型組比均顯著下調(diào)（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾體苷組比 SACC-LM C21甾體苷組下調(diào)更明顯（P＜0.01）。對(duì)于Bax蛋白水平，SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組與各自模型組比均顯著上調(diào)（P＜0.01），且SACC-83 C21甾體苷組比SACC-LM C21甾體苷組上調(diào)更明顯（P＜0.01）。對(duì)于 caspase-3 的蛋白水平，SACC-83C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組與各自的模型組比均顯著上調(diào)（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾體苷組比SACC-LM C21甾體苷組上調(diào)更明顯（P＜0.01）。見(jiàn)表2和插頁(yè)圖3。

表2 C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與各自模型組比較，*P＜0.01；與 SACC-LM C21甾體苷組比較，△P＜0.01

組別SACC-83模型組SACC-83 C21甾體苷組SACC-LM模型組SACC-LM C21甾體苷組鼠數(shù)6 6 6 6 Bcl-2 1.000±0.069 0.563±0.072*△1.155±0.071 0.664±0.061*Bax 1.000±0.072 1.969±0.181*△0.844±0.062 1.521±0.120*caspase-3 1.000±0.093 3.028±0.256*△0.890±0.036 1.934±0.188*

表3 C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與各自模型組比較，*P＜0.01；與 SACC-LM C21甾體苷組比較，△P＜0.01

組別SACC-83模型組SACC-83 C21甾體苷組SACC-LM模型組SACC-LM C21甾體苷組鼠數(shù)6 6 6 6 Bcl-2 1.002±0.072 0.563±0.014*△1.172±0.133 0.649±0.065*Bax 1.005±0.122 1.660±0.227*△0.817±0.071 1.313±0.115*caspase-3 1.001±0.040 2.604±0.174*△0.886±0.087 1.746±0.080*

3.4 C21甾體苷對(duì)各組瘤體組織中Bcl-2、Bax和caspase-3基因的mRNA水平的影響 對(duì)于Bcl-2，SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組的mRNA水平與各自模型組比均顯著降低（P＜0.01），且SACC-83 C21甾體苷組比SACC-LM C21甾體苷組下降更明顯（P＜0.01）。對(duì)于 Bax，SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組的mRNA水平與各自模型組比均顯著升高（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾體苷組比SACC-LM C21甾體苷組升高更明顯（P＜0.01）。對(duì)于 caspase-3，SACC-83 C21甾體苷組和SACC-LM C21甾體苷組的mRNA水平相較于各自的模型組均顯著升高（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾體苷組比SACC-LM C21甾體苷組升高更明顯（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

4 討論

C21甾體苷主要分布于蘿藦科植物如烏骨藤、白首烏中，因其重要的藥用價(jià)值而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Yin等[4]研究發(fā)現(xiàn)，C21甾體苷能夠有效抑制肝癌細(xì)胞（HepG2）的增殖，且可通過(guò)誘導(dǎo)G1期阻滯，上調(diào)caspase-3、caspase-9和Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。Ye等[7]發(fā)現(xiàn)暴露于21.6μM C21甾體苷中的人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）顯示出典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的特性，如核染色質(zhì)凝聚和凋亡小體的形成，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示凋亡細(xì)胞的百分比增加至43.2%，且caspase-3表達(dá)和活性增加3倍。王冬艷等[8]同樣發(fā)現(xiàn)C21甾體苷處理后的肝癌細(xì)胞電鏡下可見(jiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變，免疫組化結(jié)果表明C21甾體苷可顯著降低高表達(dá)的Bcl-2水平從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。眾多研究表明，C21甾體苷可以通過(guò)調(diào)控凋亡基因的表達(dá)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C21甾體苷能顯著抑制腫瘤的增長(zhǎng)，SACC-83組和SACC-LM組的抑瘤率分別為26.8%和24.8%。病理學(xué)結(jié)果顯示，C21甾體苷藥物治療后能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤組織凋亡壞死，減輕肺轉(zhuǎn)移和癌旁組織損傷。Western blot結(jié)果顯示，C21甾體苷治療后能顯著下調(diào)腫瘤組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平，上調(diào)caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平。qPCR結(jié)果同樣表明，C21甾體苷治療后能顯著抑制Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，上調(diào)caspase-3和Bax mRNA表達(dá)水平。

細(xì)胞凋亡有外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體兩條途徑，最終信號(hào)都會(huì)傳導(dǎo)至細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者caspase，活化的caspase會(huì)激活核酸內(nèi)切酶，DNA鏈斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)崩解，細(xì)胞凋亡[9]。Caspase是細(xì)胞凋亡的主要推動(dòng)力，而caspase-3則被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的執(zhí)行者。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2參與SACC的發(fā)生，且Bcl-2在終末期SACC中顯著高表達(dá)并與SACC的惡性程度及組織學(xué)分期顯著相關(guān)[10-11]。在SACC中，致癌基因PIM激酶的抑制劑SGI-1776則是通過(guò)增加caspase-3的活性，降低Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和線粒體去極化，從而引起的細(xì)胞凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)中，Western blot和qPCR分析同樣發(fā)現(xiàn)Bcl-2在SACC-83及SACC-LM細(xì)胞株荷瘤裸鼠中呈高表達(dá)，而caspase-3和Bax的表達(dá)水平則較低。C21甾體苷治療后下調(diào)了高表達(dá)的Bcl-2水平，上調(diào)caspase-3和Bax表達(dá)水平，表明C21甾體苷可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程，從而對(duì)SACC起到顯著的抑制作用。

綜上所述，C21甾體苷可顯著抑制腫瘤體積的增長(zhǎng)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，上調(diào)caspase-3和Bax表達(dá)水平，誘導(dǎo)SACC的細(xì)胞凋亡，從而對(duì)SACC起到抑制作用。本實(shí)驗(yàn)可能為C21甾體苷治療SACC提供理論依據(jù)和臨床參考，但其遠(yuǎn)期效果和確切機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。