梁若笳應(yīng)家樂(lè) 朱 磊

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，術(shù)后以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是目前的基礎(chǔ)治療。化學(xué)增敏和預(yù)防治療抗性具有重要的臨床意義。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞耐藥性的發(fā)展與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)，而 MAPK/ERK、PI3K/ART、PKC/GSK-3β 等多條信號(hào)通路均參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要途徑，與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是中藥紅花的水溶性提取物，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的雙重作用，但具體機(jī)制尚不明確[3]。本研究旨在觀察HSYA在逆轉(zhuǎn)A2780/DDP的順鉑耐藥中的作用及對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，探討HSYA逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康BALB/C雌性裸鼠20只，3～4周齡，體質(zhì)量18.0～20.0g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]。SPF條件下飼養(yǎng)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2014-0008]，溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%，每 12h予亮暗循環(huán)，2周更換1次敷料，用無(wú)菌水及飼料飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞株 順鉑耐藥人卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 HSYA購(gòu)于江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)146087-19-6，純度：＞98%；DDP購(gòu)于德州德藥制藥有限公司，批號(hào)37020523；RPMI 1640培養(yǎng)基，批號(hào)61870044、DMEM培養(yǎng)基，批號(hào)10569044、胰酶，批號(hào)25200072均購(gòu)于Gibco公司；胎牛血清，批號(hào)51342購(gòu)于Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline，PBS），批號(hào) 0061購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司；ECL Plus試劑盒，批號(hào)1705060購(gòu)于Bio-Rad公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，批號(hào)P0015L、RIPA細(xì)胞裂解液，批號(hào)P0013B、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，批號(hào)P0009均為碧云天公司產(chǎn)品；Tris堿，批號(hào)10708876001購(gòu)于Sigma 公司；兔抗 Akt，批號(hào) 9272、兔抗 p-Akt，批號(hào)81283、兔抗GAPDH批號(hào)2118S均購(gòu)于CST公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)器材與設(shè)備 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；RM2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210型攤片機(jī)、HI1220型烘片機(jī)均為L(zhǎng)eica公司產(chǎn)品；BH2型顯微鏡購(gòu)于Olympus公司；BM-1000型光學(xué)顯微鏡購(gòu)于南京江南永新光學(xué)有限公司。1681130-4B型酶標(biāo)儀、Mini-Proten Tetra System型電泳系統(tǒng)和ChemiDocTMTouch Imaging System型凝膠成像儀均購(gòu)于Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A2780/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100ng/mL鏈霉素和2μg/mL DDP的1640培養(yǎng)基中，保持培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2濃度為5%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞造模。

2.2 裸鼠移植瘤模型構(gòu)建 制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，在超凈臺(tái)內(nèi)對(duì)20只裸鼠進(jìn)行接種。將細(xì)胞懸液注入實(shí)驗(yàn)裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每只0.2mL，待皮下移植瘤長(zhǎng)至直徑3mm時(shí)即為順鉑耐藥卵巢癌模型鼠造模成功。

2.3 分組及藥物干預(yù) 成功接種2周后每只模型鼠皮下移植瘤體積約60mm3。采用隨機(jī)數(shù)字表將模型鼠分為對(duì)照組、紅花組、順鉑組和聯(lián)合組，每組5只。對(duì)照組以0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，紅花組予HSYA 1.1g/kg腹腔注射，順鉑組予順鉑3mg/kg腹腔注射，聯(lián)合組予 HSYA（1.1g/kg）聯(lián)合順鉑（3mg/kg）腹腔注射。每3天1次，連續(xù)給藥4周。

2.4 觀察小鼠生長(zhǎng)情況 5周后處死小鼠，解剖取腫瘤放于電子天平稱重，記錄瘤體重量，并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤體質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組瘤體質(zhì)量）/對(duì)照組瘤體質(zhì)量×100%。

2.5 病理觀察 取一部分腫瘤組織經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色后鏡下觀察腫瘤形態(tài)學(xué)改變。

2.6 Western blot檢測(cè) 取每組剩余腫瘤組織研磨，離心，使用考馬斯亮藍(lán)染料法測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE緩沖液稀釋等量蛋白，再進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，分離的蛋白帶電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶室溫封閉1h，分別用Akt、p-Akt和Gapdh單克隆抗體孵育4℃過(guò)夜。Tris緩沖液洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，Tris緩沖液洗膜，加入ECL，混勻后加在PVDF膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。使用Image J軟件分析各條帶光密度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，不同組間瘤重、體積等比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組小鼠腫瘤HE染色結(jié)果（HE染色 200×）

圖2 HSYA對(duì)小鼠腫瘤組織內(nèi)Akt、p-Akt表達(dá)的影響

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況比較 小鼠腫瘤大體觀察，與對(duì)照組比較，順鉑組、聯(lián)合組小鼠瘤體質(zhì)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），紅花組小鼠瘤體質(zhì)量差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與順鉑組比較，紅花組、聯(lián)合組瘤體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與紅花組相比，聯(lián)合組瘤體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與順鉑組相比，聯(lián)合組抑瘤率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較（±s）

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與順鉑組比較，△P＜0.05；與紅花組比較，▲P＜0.05；對(duì)照組以0.9%氯化鈉溶液腹腔注射；紅花組予HSYA 1.1g/kg腹腔注射；順鉑組予順鉑3mg/kg腹腔注射；聯(lián)合組予HSYA（1.1g/kg）聯(lián)合順鉑（3mg/kg）腹腔注射；HSYA：羥基紅花黃色素A

組別對(duì)照組順鉑組紅花組聯(lián)合組鼠數(shù) 抑瘤率（%）5 5 5 5腫瘤質(zhì)量（g）4.71±0.17 3.53±0.28*4.54±0.25△2.76±0.17*△▲25.08 3.61 41.36△

3.2 各組小鼠腫瘤形態(tài)學(xué)變化比較 對(duì)照組及紅花組細(xì)胞形態(tài)較為一致，核質(zhì)比例高，順鉑組及聯(lián)合組出現(xiàn)不同程度的片狀壞死區(qū)，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮及碎裂，聯(lián)合組腫瘤壞死程度較順鉑組高。見(jiàn)插頁(yè)圖1。

3.3 HSYA對(duì)小鼠腫瘤組織Akt、p-Akt表達(dá)影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，順鉑組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而紅花組與聯(lián)合組的Akt、p-Akt蛋白表達(dá)低于對(duì)照組與順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HSYA可以下調(diào)Akt、p-Akt蛋白質(zhì)表達(dá)。見(jiàn)插頁(yè)圖2、表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠腫瘤組織Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與順鉑組比較，△P＜0.05；對(duì)照組以 0.9%氯化鈉溶液腹腔注射；紅花組予HSYA 1.1g/kg腹腔注射；順鉑組予順鉑3mg/kg腹腔注射；聯(lián)合組予HSYA（1.1g/kg）聯(lián)合順鉑（3mg/kg）腹腔注射；Akt：蛋白激酶 B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶 B；HSYA：羥基紅花黃色素A

組別對(duì)照組順鉑組紅花組聯(lián)合組鼠數(shù)5 5 5 5 Akt蛋白0.61±0.11 0.62±0.09 0.42±0.10*△0.44±0.07*△p-Akt蛋白0.59±0.02 0.59±0.04 0.54±0.05*△0.56±0.05*△

4 討論

卵巢癌是女性常見(jiàn)癌癥，約占女性新發(fā)癌癥病例的4%[3]。目前臨床上以順鉑為主的化療是殺死卵巢癌細(xì)胞的主要手段。但化療后的獲得性耐藥是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展主要原因。

卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的分子機(jī)制尚不明確，近年研究發(fā)現(xiàn)與EMT狀態(tài)密切有關(guān)。其中參與調(diào)控卵巢癌EMT的PI3K/AKT信號(hào)通路已被證實(shí)在多種癌癥中被激活，目前已成為研究及干預(yù)卵巢癌耐藥的熱門(mén)靶點(diǎn)。作為細(xì)胞生存的重要通路，PI3K/Akt信號(hào)通路在促進(jìn)增殖和侵襲、抑制凋亡、促進(jìn)血管生成、抵抗放化療等方面起著重要作用[4]。PI3K是一種磷脂激酶，由催化亞基（p110）和調(diào)節(jié)亞基（p85）組成，其主要下游效應(yīng)物絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，也稱為蛋白激酶，活化的Akt在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和凋亡中起重要作用[5]。Huang等[6]采用陣列CGH來(lái)分析卵巢癌中的遺傳畸變，確定PI3K/AKT途徑是遺傳水平上最常受影響的癌癥途徑。70%左右的卵巢癌伴有PI3K/AKT/mTOR的激活，促進(jìn)過(guò)度活躍的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、生存、代謝和血管生成[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Akt激活能提高卵巢癌細(xì)胞的存活，并通過(guò)衰減的p53促凋亡信號(hào)促進(jìn)化學(xué)抗性[8]。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT對(duì)人上皮性卵巢癌順鉑耐藥有顯著影響，而抑制PI3K/AKT通路能顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Wang等[10]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用順鉑比較，聯(lián)合AKT抑制劑哌立福能顯著增加卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞凋亡，改善腫瘤控制情況。

紅花黃色素源自中藥紅花，其有效成分HSYA具有促進(jìn)腫瘤凋亡、干擾血管生成、抑制轉(zhuǎn)移的作用[11]。本研究顯示，與對(duì)照組與順鉑組，紅花組小鼠的瘤體重量、抑瘤率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，病理也無(wú)明顯的腫瘤凋亡，說(shuō)明單純使用紅花沒(méi)有明顯抑制腫瘤的效果。然而，與順鉑組相比，同時(shí)應(yīng)用順鉑和HSYA能夠有效抑制A2780/DDP的生長(zhǎng)。Western blot結(jié)果顯示，紅花組和聯(lián)合組Akt、p-Akt蛋白均有下降?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，我們猜測(cè)，HSYA增強(qiáng)A2780/DDP對(duì)順鉑的敏感性、逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的機(jī)制在于下調(diào)PI3-K/AKT途徑的Akt、p-Akt蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示HSYA可能通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT途徑的關(guān)鍵組分Akt、p-Akt蛋白，來(lái)增強(qiáng)A2780/DDP對(duì)順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。關(guān)于HSYA是否會(huì)通過(guò)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制抑制人卵巢癌A2780/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)，尚需進(jìn)一步深入研究。