王智杰王 磊 鄭益志

銀屑病（psoriasis）是一種慢性炎癥性皮膚疾患。目前用來治療銀屑病的藥物主要受到耐藥性及給藥途徑的影響[1]。研究表明，過度表達(dá)KLF6（Kruppellike factor 6）基因的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)顯著凋亡，并伴有p21mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，KLF6通過上調(diào)p21來促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抑制炎癥反應(yīng)等生物學(xué)作用，研究表明，姜黃素濃度依賴性的促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的凋亡[3]。本研究選用外源性血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）刺激HaCaT細(xì)胞模擬銀屑病體外增殖模型，選用姜黃素來抑制VEGF促HaCaT細(xì)胞增殖作用，觀察處理后KLF6、p21蛋白表達(dá)情況，對KLF6/p21信號通路與銀屑病的相關(guān)性進(jìn)行實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 藥 物 姜黃素（規(guī)格：1g，美國Sigma公司130823）。

1.2 試劑與儀器 VEGF（英國abcam公司）、胎牛血清（140112）（杭州四季青有限公司）、二甲基苯酚（131115）（天津天河化學(xué)試劑廠）、CCK-8（130926）（美國sigma公司）、蛋白酶抑制劑（140218）（美國sigma公司）、兔多克隆KLF6抗體及小鼠單克隆p21抗體（140129）（英國abcam公司）、生物素標(biāo)記二抗（131225）(美國 Jackson公司)、細(xì)胞凋亡試劑盒（131130）（杭州聯(lián)科生物有限公司）、倒置顯微鏡（XPS-18）（COIC 公司）、超凈工作臺（SW-II-A/B3）（上凈凈化公司）、CO2培養(yǎng)箱（3111）（Thermo Forma公司）、冷凍高速離心機(jī)（CL17R）（Thermo Forma公司）、低溫高速離心機(jī)（CL31R）（Thermo Forma公司）、流式樣細(xì)胞儀（FC500）（貝克曼公司）。

2 實驗方法

2.1 HaCaT培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞在5%CO2，37℃恒溫條件下培養(yǎng)于含高糖DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）的無菌培養(yǎng)瓶中，于倒置顯微鏡下密切觀察HaCaT細(xì)胞生長情況。細(xì)胞融合約瓶底70%～80%的狀態(tài)時，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次后加入適量胰酶。37℃孵育至HaCaT細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙明顯增寬，在超凈臺中加入適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液終止其消化，反復(fù)吹打使貼壁細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管，800r/min離心5min，然后收集細(xì)胞。加入新的培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打至細(xì)胞均勻懸浮，以1：3的比例接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜置。

2.2 CCK-8實驗（Cell Counting Kit-8） 收集HaCaT細(xì)胞，計數(shù)并按每孔1×104個細(xì)胞濃度接種至96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，邊緣用無菌PBS填充。每孔加入100μL用無血清1640培養(yǎng)液稀釋的含有不同濃度的姜黃素（0，5，10，15，20，30，40umol/L），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育24h（37℃，5%CO2的條件下）。向每孔加入10μL的CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4h。用酶標(biāo)儀檢測其在450nm值處的吸光度。待細(xì)胞長滿96孔板板底約60%時，將其移出培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌兩次；每孔加入100μL用無血1640稀釋的姜黃素和VEGF，本實驗設(shè)四組：空白對照組，20μmol/L姜黃素組，25ng/mLVEGF組，25ng/mLVEGF聯(lián)合20μmol/L姜黃素組，繼續(xù)孵育24h。

2.3 免疫印跡技術(shù)（Western Blot） 取處在其對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液300μL，冰上裂解 30min，12000r/min 離心 10min，提取蛋白行SDS-PAGE電泳、將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下封閉1h，按1：1000比例用封閉液分別稀釋KLF6、p21、β-actin 抗體，4℃條件下旋轉(zhuǎn)孵育過夜，二抗室溫下常溫旋轉(zhuǎn)孵育 2h，TBST洗膜 3次（10min/次），ECL試劑盒孵育后暗盒曝光。

圖1 VEGF聯(lián)合姜黃素對HaCaT細(xì)胞P21蛋白表達(dá)的影響

圖2 VEGF聯(lián)合姜黃素對HaCaT細(xì)胞KLF6蛋白表達(dá)的影響

圖3 姜黃素和VEGF對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

2.4 流式細(xì)胞技術(shù) 取處于對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，待細(xì)胞長至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部約60%～70%時移出培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌2次。每瓶加入等體積無血清1640稀釋的姜黃素或（和）VEGF，孵育24h。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶將HaCaT細(xì)胞消化，收集細(xì)胞至離心管中，1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000r/min離心5min，棄去PBS。細(xì)胞沉淀加入適量預(yù)冷的1XBinding Buffer重懸，使細(xì)胞濃度為 1×106～1×107個細(xì)胞/mL。每個樣品管中加入 100uL細(xì)胞懸液，約 1×105～1×106個細(xì)胞/每管。每管加入5μL Annexin V-PE和10μL 7-AAD。輕柔渦旋混勻后，室溫下避光靜置15min。無需洗滌，每管加入380μL預(yù)冷的1XBinding Buffer，流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，各組間計量資料的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。組間比較采用獨立樣本的t檢驗，相關(guān)性采用Pearson分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖情況 姜黃素在0～40μmol/L內(nèi)濃度依賴性的抑制HaCaT細(xì)胞增殖，20μmol/L的姜黃素對 HaCaT細(xì)胞有明顯的抑制作用（P＜0.01），在0～40μmol/L范圍內(nèi)HaCaT細(xì)胞增殖與姜黃素濃度呈線性相關(guān)（r=-0.92，P＜0.01）。見表1；與空白對照組相比，25ng/mLVEGF對HaCaT細(xì)胞有明顯的促增殖作用（P＜0.05），20μmol/L姜黃素可明顯抑制 HaCaT細(xì)胞增殖；20μmol/L姜黃素明顯抑制 25ng/mL VEGF對 HaCaT細(xì)胞的促增殖作用（P＜0.01）。見表2。

表1 不同濃度姜黃素對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響（n=7，±s）

表1 不同濃度姜黃素對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響（n=7，±s）

注：t值為不同姜黃素濃度與空白對照組（姜黃素濃度為0μmol/L）比較

姜黃素濃度（umol/L）t值P值0 5 1 0 15 20 30 40吸光度值0.853±0.083 0.844±0.026 0.830±0.044 0.575±0.118 0.336±0.370 0.262±0.030 0.260±0.018 0.215 0.545 4.280 12.708 14.984 15.635＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 姜黃素和VEGF對 HaCaT細(xì)胞增殖的影響（n=4，±s）

表2 姜黃素和VEGF對 HaCaT細(xì)胞增殖的影響（n=4，±s）

注：*：與空白對照組比較；△：與 25ng/mL VEGF組比較；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別空白對照組25ng/mLVEGF組20μmol/L姜黃素組25ng/mLVEGF+20μmol/L姜黃素組吸光度值0.866±0.067 0.981±0.061*0.345±0.047*0.419±0.089△t值P值-2.853 14.231 11.624＜0.05＜0.01＜0.01

3.2 免疫蛋白印跡結(jié)果 與空白對照組比較，25ng/mL VEGF可上調(diào)HaCaT細(xì)胞p21蛋白表達(dá)，20μmol/L姜黃素組可下調(diào)其KLF6，p21蛋白表達(dá)，20μmol/L姜黃素組能抑制25ng/mLVEGF組對HaCaT細(xì)胞KLF6，p21蛋白的上調(diào)作用，本實驗重復(fù)3次，結(jié)果相似，見插頁圖1-2。

3.3 流式細(xì)胞儀試驗結(jié)果 與空白對照組比較，20μmol/L姜黃素組可明顯促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡；與25ng/mL VEGF組比較，20μmol/L姜黃素組可明顯促進(jìn)25ng/mLVEGF影響下的HaCaT細(xì)胞凋亡，本實驗重復(fù)3次，結(jié)果相似，見插頁圖3。

4 討論

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性復(fù)發(fā)性皮膚疾患治療主要采用局部療法或局部和全身療法結(jié)合的方法[4]。VEGF在銀屑病皮損中存在高水平表達(dá)情況[5]。VEGF抑制劑通過阻礙VEGF信號通路可能成為治療銀屑病的一種新方法[6]。

KLF6參與細(xì)胞增殖、凋亡、生長、分化等過程，KLF6在多種組織中普遍表達(dá)。它的失活或表達(dá)異常參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和發(fā)育中扮演著重要的角色[7]。p21基因?qū)?xì)胞周期有明顯的負(fù)性調(diào)控作用，能夠參與細(xì)胞的多種生物功能活動，既能抵抗凋亡，又能促進(jìn)凋亡、抑制增殖[8]。p21基因是KLF6基因的直接靶基因，野生型KLF6基因有不依賴p53介導(dǎo)上調(diào)p21的作用，從而顯著降低細(xì)胞增殖[9]。

姜黃素安全系數(shù)高，連續(xù)4個月服用姜黃素3600～8000mg除見輕微的嘔吐和腹瀉，未見其他明顯副反應(yīng)[10]，姜黃素具有明顯的抗炎及抗細(xì)胞增殖作用[11]，現(xiàn)已用于多種銀屑病等皮膚科疾病的治療，且取得良好的臨床療效。

本實驗選取 0、5、10、15、20、30、40μmol/L 的濃度梯度進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素在0～40μmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴性促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡，20μmol/L姜黃素明顯促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡。與空白對照組相比，25ng/mL VEGF組能明顯促進(jìn)HaCaT細(xì)胞KLF6/p21蛋白表達(dá)；20μmol/L姜黃素可有效抑制HaCaT細(xì)胞的KLF6/p21表達(dá)水平，還可下調(diào)25ng/mLVEGF對HaCaT細(xì)胞KLF6/p21的促表達(dá)作用。據(jù)此推測KLF6可能通過正性調(diào)節(jié)p21的表達(dá)來參與銀屑病的發(fā)病，姜黃素可通過下調(diào)KLF6/p21表達(dá)水平抑制HaCaT細(xì)胞增殖局部炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療銀屑病的目的。