謝曉彬， 曾 艷， 鄧曉華， 楊志宏

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 深圳 518100)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起乙型肝炎的病原體，在世界范圍約有20億感染者，其中超過(guò)3.5億人是HBV攜帶者，15%～40%的感染者會(huì)發(fā)展為肝功能衰竭、肝硬化或肝癌，每年導(dǎo)致約100萬(wàn)人的死亡[1]。血液和血液制品傳染、密切接觸傳染、醫(yī)源性傳染、母嬰傳染(宮內(nèi)，分娩，母乳喂養(yǎng))是HBV感染的主要途徑，其中母嬰傳染約占HBV傳染的50%。孕婦將HBV傳染給子代，主要發(fā)生在3個(gè)時(shí)期：產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)和產(chǎn)后。產(chǎn)前傳染，也就是宮內(nèi)傳染，即乙肝病毒通過(guò)胎盤(pán)感染胎兒[2]。在我國(guó)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性孕婦的宮內(nèi)感染率在15%～25%[3]。目前對(duì)HBV宮內(nèi)感染的機(jī)理仍有待研究，但已證實(shí)遺傳易感性和各種母體特征(即分娩方式，流產(chǎn)史，產(chǎn)前出血，母體HBV DNA載量和妊娠期HBV感染的血清標(biāo)志物)均對(duì)宮內(nèi)感染有影響[4-5]。樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)粘附分子(ICAM)-3抓取非整合素(CD209)和肝/淋巴結(jié)特異性ICAM-3抓取非整合素(CD209L)是都是跨膜C型凝集素，是鈣依賴性碳水化合物結(jié)合蛋白，可以充當(dāng)細(xì)胞粘附和病原體識(shí)別受體[6-8]。 研究表明CD209/CD209L可通過(guò)C-末端C-型碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域捕獲人類(lèi)免疫缺陷、埃博拉、乙型肝炎、登革熱、巨細(xì)胞、SARS冠狀等多種病毒[9-10]。本研究對(duì)HBV陽(yáng)性孕婦CD209/CD209L基因多態(tài)性與宮內(nèi)感染的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2016年1月-2018年6月在深圳市龍崗中心醫(yī)院婦產(chǎn)科接生的HBV陽(yáng)性孕婦110例為研究對(duì)象，根據(jù)新生兒是否出現(xiàn)宮內(nèi)感染(以新生兒出生時(shí)注射乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白前抽取新生兒股靜脈血檢測(cè) HBsAg≥0.05 IU/mL、HBV DNA>103 copy/mL為診斷HBV宮內(nèi)感染的指標(biāo))分為感染組60例和非感染組50例。2組孕婦在年齡、孕周、HBV DNA等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究按照赫爾辛基宣言進(jìn)行，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦參與前均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 CD209、CD209L單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)

1.2.1 血液中DNA樣品的提取純化 2組孕婦肱靜脈抽血4 mL，加入EDTA-K2抗凝，5 000 r/min 離心5 min，棄除血清后加入人紅細(xì)胞裂解液300 μL, 混勻震蕩3 min,10 000 r/min 離心30 s，取400 μL裂解物置于含有20 μL蛋白酶K的2 mL微量離心管中，56℃溫育10 min后，加入400 μL乙醇混勻。取700 μL混合物置于QIAamp旋轉(zhuǎn)柱以8 000 r/min離心1 min，將QIAamp旋轉(zhuǎn)柱置于2 mL收集管中，棄去濾液。重復(fù)離心步驟后，將500 mL AW1緩沖液加入旋轉(zhuǎn)柱中，8 000 r/min離心1 min，將500 mL AW2緩沖液加入旋轉(zhuǎn)柱中，8 000 r/min離心1 min。將QIAamp Spin Column置于1.5 mL微量離心管中，加入150 μLAE緩沖液，室溫下孵育1 min后，以8 000 r/min離心1 min，將純化的DNA保存在-20℃冰箱中，備用。

1.2.2 CD209 SNP位點(diǎn)CD209、CD209L DNA的擴(kuò)增 CD209 SNP位點(diǎn)的 PCR 擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物為正向5“-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3”和反向5“GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3”。 CD209L SNP位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物為正向5“-ATCGTGACTTAGACTACTACCAAGCT-3”和反向5“GTCGTTCTGAAAAAGCATTCCTTAA-3”。參照Platinum Taq PCR試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)操作說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，將96微孔板置于GeneAmp PCR System 9700型酶標(biāo)儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃1 min，然后30個(gè)循環(huán)95℃30 s，55℃30 s，和72℃ 30 s。

1.2.3 CD209、CD209L單核苷酸多態(tài)性檢測(cè) 將8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)限制酶過(guò)夜消化，采用4%瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(BMA，Rockland，ME，USA)分析確定CD209、CD209L單核苷酸的多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與感染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率與感染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系采用二元Logistic 回歸分析，以O(shè)R和95%CI表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209 77、55基因型比例比較與非感染組CD209 77、55基因型比例(42.0%、48.0%)比較，感染組CD209 77、55基因型比例(45.0%、48.2%)升高， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD209 77基因型不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.055，95CI%=0.759 0～1.466 5，P>0.05),見(jiàn)表1。

2.2 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209 7、5等位基因頻率比較與非感染組CD209 7等位基因型頻率(50.0%)比較，感染組CD209 7等位基因型頻率(48.3%)降低， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與非感染組CD209 5等位基因型頻率(50.0%)比較，感染組CD209等位基因型頻率(51.7%)升高， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD209 7等位基因頻率不能增加過(guò)宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.968，95CI%=0.745～-1.257，P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209 77、75、55基因型比例比較/例(%)

表2 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦 CD209 7、5等位基因頻率比較/例(%)

2.3 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 77、75、55基因型比例比較與非感染組CD209L 77基因型比例(36.0%)比較，感染組CD209L 77基因型比例(66.7%)升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與非感染組CD209L 55基因型比例(54.0%)比較，感染組CD209L 77基因型比例(18.3%)降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD209L77基因型能增加過(guò)宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.920，95%CI=1.269～2.904，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 77、75、55基因型比例比較/例(%)

注：與非感染組比較，*P<0.05。

2.4 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 7、5等位基因頻率比較與非感染組CD209L 7等位基因頻率(40.0%)比較，感染組CD209L 7等位基因頻率(73.3%)升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與非感染組CD209L 5等位基因頻率(60.0%)比較，感染組CD209L 5等位基因頻率(26.7%)降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD209L 7等位基因頻率能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=2.25，95%CI=1.606～3.152，P<0.05), 見(jiàn)表4。

表4 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 7、5等位基因頻率比較/例(%)

注：與非感染組比較，*P<0.05。

2.5 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 99、97、77基因型比例比較與非感染組CD209L 99基因型比例(48.0%)比較，感染組CD209L 99基因型比例(43.0%)降低， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與非感染組CD209L 77基因型比例(38.0%)比較，感染組CD209L 77基因型比例(40.0%)升高， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 99基因型不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.059，95%CI=0.782～1.433，P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 99、97、77基因型比例比較/例(%)

2.6 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦 CD209L 9、7各等位基因頻率比較與非感染組CD209L 9等位基因頻率(56.0%)比較，感染組CD209L 9等位基因頻率(51.7%)降低， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與非感染組CD209L 7等位基因頻率(44.0%)比較，感染組CD209L 7等位基因頻率(49.3%)升高， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 9等位基因頻率不能增加過(guò)宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.103，95%CI=0.860～1.416，P>0.05),見(jiàn)表6。

2.7 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 66、65、55基因型突變型比較與非感染組CD209L 66、55基因型比例(56.0%、30.0%)比較，感染組CD209L 66、55基因型比例(56.6%、30.3%)升高， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 66基因型不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.957，95%CI=0.819～1.549，P>0.05),見(jiàn)表7。

表6 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦 CD209L 9、7等位基因頻率比較/例(%)

表7 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦CD209L 66、65、55基因型突變型比較/例(%)

2.8 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦 CD209L 6、5等位基因頻率比較與非感染組CD209L 6、5等位基因頻率(68.0%、32.0%)比較，感染組CD209L 77、55等位基因頻率(69.0%、35.0%)升高， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 6等位基因頻率不能增加過(guò)宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.841、95%CI=0.934～1.369，P>0.05),見(jiàn)表8。

表8 非感染組、感染組HBV陽(yáng)性孕婦 CD209L 6、5等位基因頻率比較/例(%)

3 討論

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人類(lèi)基因組中最常見(jiàn)的遺傳變異形式，其中一部分對(duì)人體對(duì)疾病易感性有影響，樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)黏附分子基因多態(tài)性在疾病易感性中具有相當(dāng)大的作用。與構(gòu)成膜結(jié)合模式識(shí)別受體的樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)黏附分子基因家族的其他成員不同，CD209和CD209L主要位于細(xì)胞內(nèi)吞區(qū)室； CD209識(shí)別病毒衍生的dsRNA以及poly C(1種合成的dsRNA類(lèi)似物)，CD209L識(shí)別細(xì)菌和病毒中存在的未甲基化的CpG基序。CD209通過(guò)使用含有CD209-IL1R結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導(dǎo)干擾素-β(TRIF)通過(guò)髓樣分化初級(jí)應(yīng)答蛋白88(MyD88)非依賴性途徑介導(dǎo)其功能效應(yīng)，通過(guò)誘導(dǎo)干擾素導(dǎo)致抗病毒活性和/或凋亡和caspase招募。而CD209L通過(guò)MyD88依賴性途徑起作用，導(dǎo)致NF-κB活化，細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)[11-13]。

存在于染色體4上的CD209基因的外顯子7/5多態(tài)性通過(guò)改變CD209胞外域和功能而影響受體-配體相互作用。CD209 7/5多態(tài)性存在于CD209基因的外顯子2中，并且可能影響mRNA水平的表達(dá)。CD209通過(guò)MyD88依賴性途徑起作用，導(dǎo)致NF-κB活化，細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)。具有DNA基因組的病毒，例如HBV病毒，可能潛在地激活CD209，其響應(yīng)于CpG DNA而被激活，以誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)。有研究評(píng)估CD209(7/5)基因多態(tài)性與日本、德國(guó)、美國(guó)HBV孕婦宮內(nèi)感染易感性之間的關(guān)聯(lián)，CD209(7/5)等位基因頻率分別為34.0%、55.4%和57.0%，表明宿主遺傳因素在個(gè)體間差異與疾病易感性方面的相關(guān)性[14-15]，這與本次研究顯示CD209 77基因型、 CD209 7等位基因頻率不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)果相一致。

本研究表明，CD209L77基因型、CD209L 7等位基因頻率能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)，說(shuō)明CD209L 77基因型與HBV宮內(nèi)感染結(jié)局相關(guān)[16-17]。該特定CD209L 77基因型在HBV宮內(nèi)感染中的功能意義的表征可提供導(dǎo)致新型預(yù)防和治療方法的發(fā)展的見(jiàn)解。仍需要進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)并進(jìn)一步探討HBV宮內(nèi)感染與易感基因之間的關(guān)系，以及可能與HBV宮內(nèi)感染有關(guān)的任何其他風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果同時(shí)也提示CD209、CD209L 9/7、CD209L 6/5等位基因突變與HBV宮內(nèi)感染無(wú)關(guān)。