帕麗達(dá)·阿不力孜， 熱娜古麗·海里吾， 叢媛媛， 胡君萍， 米仁沙·牙庫甫

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

復(fù)方小艾飛蜜膏是由金錢白花蛇、高良姜、胡椒、蓽撥、干姜5味藥材組成的抗癌制劑，高良姜為該抗癌制劑的主藥，臨床上常用于胃癌、食道癌、消化道和生殖系統(tǒng)炎癥等的治療，課題組前期研究已證實(shí)該復(fù)方對胃癌具有良好的治療作用[1]。高良姜為姜科山姜屬植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖，具有祛風(fēng)、溫胃、行氣、散寒、止痛等功效[2]，主要含黃酮類、揮發(fā)油類、二芳基庚烷類及多糖類成分，具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、免疫促進(jìn)、抗菌等藥理活性[3]。目前國內(nèi)外研究主要集中于高良姜中黃酮類、二芳基庚烷類成分的抗腫瘤、降血糖和降血脂等活性[4-7]，對高良姜多糖的研究僅限于其最佳提取工藝[8]及降膽固醇、抗氧化活性[9-10]，未見高良姜多糖抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道。本研究通過建立小鼠MFC移植瘤模型，擬探究高良姜多糖的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Smart Cell HF-90型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司)，HF1200LC型生物安全柜上(海力康儀器有限公司)，Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海力康儀器有限公司)，TGL-16GB型臺式低速離心機(jī)(上海飛鴿儀器有限公司)，DK-80型恒溫水浴鍋(上海精宏儀器廠)，YDS-50-125型液氮罐(成都金鳳儀器廠)，DW-HL388型-20℃低溫冰箱(合肥美菱公司)，DW-HL290型-80℃低溫冰箱(合肥中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)，AB304-S型電子分析天平(德國梅特勒)，Research plus型手動單道移液器(德國Eppendorf公司)，xMarkTM型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，TP1020型脫水機(jī)(德國Leica公司)，EG1150型全自動石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司)，RM2235型全自動石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)，H500S型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，倒置顯微成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.2 試藥胎牛血清(美國Life technologies公司，批號：16000044)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Life technologies公司，批號：11875-093)，VEGF試劑盒(美國andygene公司，批號：AD2719MO)，PCNA試劑盒(美國andygene公司，批號：AD2574MO)，IL-2試劑盒(美國andygene公司，批號：AD2442MO)，IL-6試劑盒(美國andygene公司，批號：AD0169MO)，IFN-γ試劑盒(美國andygene公司，批號：AD2418MO)，5-氟尿嘧啶(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：20160926)。

1.3 藥材高良姜2016年7月購自新疆本草堂藥業(yè)(批號：16071335)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為姜科山姜屬植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖。

1.4 動物ICR小鼠60只，雌性，體質(zhì)量(20±2)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002，動物批號：20161227，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所SPF級動物房，恒溫恒濕，正常飲食飲水。

1.5 細(xì)胞株小鼠胃癌MFC細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫-中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 高良姜多糖的制備將高良姜用清水洗凈、去蒂、切片、干燥并粉碎，過60目篩后可得高良姜粉末。取適量的高良姜粉末，乙醚脫脂，80%乙醇除去雜質(zhì)，于95℃用水浸提3 h，抽濾后可得高良姜多糖提取液。將提取液濃縮，醇沉，離心，并用無水乙醇、丙酮、乙醚等多次洗滌沉淀，沉淀經(jīng)干燥后即得高良姜多糖。

2.2 胃癌MFC荷瘤小鼠模型的建立及給藥方法無菌條件下取對數(shù)生長期小鼠胃癌MFC細(xì)胞，制備成濃度為1.2×107個/mL的細(xì)胞懸液。隨機(jī)取50只小鼠右腋窩皮下接種細(xì)胞懸液(0.15 mL/只)，建立荷瘤小鼠模型，建模24 h后，將接種小鼠胃癌MFC細(xì)胞懸液的50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，模型組(生理鹽水，20 mL/kg體質(zhì)量)、陽性對照組(5-氟尿嘧啶，劑量25 mg/kg體質(zhì)量，每兩天腹腔注射1次)、高良姜多糖低(15 mg/kg體質(zhì)量)、中(30 mg/kg體質(zhì)量)、高(60 mg/kg體質(zhì)量)劑量組。另取10只正常小鼠作為正常組(生理鹽水，20 mL/kg體質(zhì)量)，每組小鼠每天灌胃1次，連續(xù)給藥14 d。

2.3 指標(biāo)的測定方法各組小鼠于末次給藥24 h后，稱取體質(zhì)量，處死小鼠，剝離腫瘤、胸腺、脾臟并稱重，按公式：抑瘤率%=(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100%，胸腺指數(shù)=(10×重量)/體質(zhì)量，脾臟指數(shù)=(10×重量)/體質(zhì)量，分別計(jì)算抑瘤率，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

2.4 觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎組織的病理學(xué)變化將分離出來的小鼠心、肝、脾、肺、腎組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.5 ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子的含量小鼠處死前，摘眼球取血，分離血清，按試劑盒操作流程，檢測小鼠血清中VEGF、PCNA、IL-2、IL-6和IFN-γ的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。

3 結(jié)果

3.1 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠移植瘤瘤重的影響給藥14 d后，陽性對照組、高良姜多糖低、中、高劑量組小鼠瘤重分別為(0.34±0.16)g、(0.74±0.28)g、(0.59±0.24)g、(0.46±0.26)g，各組小鼠平均抑瘤率分別為61.36%、15.91%、32.95%、47.73%。與模型組比較，陽性對照組、高良姜多糖中、高劑量組小鼠瘤重較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對照組比較，高良姜多糖低、中劑量組小鼠瘤重較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高良姜多糖高劑量組小鼠瘤重?zé)o變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

3.2 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響與模型組比較，陽性對照組小鼠胸腺指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖低、中、高劑量組間胸腺指數(shù)無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高良姜多糖高劑量組小鼠脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽性對照組、高良姜多糖低、中劑量組小鼠脾臟指數(shù)無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陽性對照組比較，高良姜多糖低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖高劑量組小鼠脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖低、中劑量組小鼠脾臟指數(shù)無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠移植瘤的影響

注：與模型組比較，*P<0.05； 與陽性對照組比較，#P<0.05。

組別胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)正常組22.60±4.12#34.69±6.21#模型組17.37±2.93#63.23±12.99陽性對照組7.99±2.93?60.40±17.87高良姜多糖低劑量組18.29±3.47#67.22±15.39高良姜多糖中劑量組19.00±5.23#71.78±18.23高良姜多糖高劑量組17.82±2.83#77.60±16.08?#

注：與模型組比較，*P<0.05； 與陽性對照組比較，#P<0.05。

3.3 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠各器官的影響與正常組比較，高良姜多糖高劑量組小鼠心、肝、腎、肺各器官的病理學(xué)切片均未見差異，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象，提示高良姜多糖對小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器無損傷作用，見圖2、3。

A：心B：肝C：腎D:肺E:脾

圖2 正常組小鼠臟器組織切片圖(HE 200×)

A：心B：肝C：腎D:肺E:脾

圖3 高良姜多糖高劑量組小鼠臟器組織切片圖(HE 200×)

3.4 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和IL-6含量的影響與模型組比較，高良姜多糖高劑量組、陽性對照組小鼠血清IL-2、IFN-γ水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖低、中劑量組間小鼠血清IL-2、IFN-γ水平無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高良姜多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠血清IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對照組比較，高良姜多糖低、中劑量組小鼠血清IL-2、IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖高劑量組小鼠血清IL-2、IFN-γ水平無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高良姜多糖低、中、高劑量組小鼠血清IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和IL-6含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05； 與陽性對照組比較，#P<0.05。

3.5 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠血清中VEGF和PCNA含量的影響與模型組比較，高良姜多糖低、中、高劑量組、陽性對照組小鼠血清VEGF水平、PCNA水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對照組比較，高良姜多糖低、中、高劑量組小鼠血清VEGF水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖低劑量組小鼠血清PCNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高良姜多糖中、高劑量組小鼠血清PCNA水平無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 高良姜多糖對胃癌MFC荷瘤小鼠血清中VEGF和PCNA含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05； 與陽性對照組比較，#P<0.05。

4 討論

5-氟尿嘧啶是臨床上治療消化道腫瘤最常用的化療藥物，它在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸后可抑制脫氧胸苷酸合成酶，干擾DNA的合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損傷和死亡。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是反映機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)。本次研究結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶可降低荷瘤小鼠胸腺指數(shù)，高良姜多糖可提高荷瘤小鼠脾臟指數(shù)，提示高良姜多糖在調(diào)節(jié)荷瘤機(jī)體免疫功能方面具有一定優(yōu)勢。輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T cell，Th cell)是主要由Th1和Th2獨(dú)立亞群構(gòu)成的一類重要的抗腫瘤免疫活性細(xì)胞。Th1型細(xì)胞可通過分泌IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子，刺激CTL細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而特異性殺傷靶細(xì)胞，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡。IFN-γ還可增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，抑制腫瘤生長。IL-6等Th2型細(xì)胞因子可降低NK細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力，造成機(jī)體免疫能力的減弱，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。Th1、Th2型細(xì)胞因子可間接反映Th1/Th2平衡，在荷瘤機(jī)體中，該平衡會向Th2漂移，且可通過正反饋機(jī)制，進(jìn)一步促進(jìn)Th2型細(xì)胞的增殖分化，抑制Th1型細(xì)胞生長[11-12]。因此，維持Th1/Th2平衡在惡性腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中具有至關(guān)重要的作用。高良姜多糖能夠提高血清中Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量，同時(shí)降低Th2型細(xì)胞因子IL-6的水平，提示高良姜多糖可通過糾正荷瘤機(jī)體Th1/Th2平衡向Th2漂移，進(jìn)而調(diào)節(jié)MFC荷瘤小鼠的免疫功能。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，誘導(dǎo)血管生成[13-14]。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)為DNA聚合酶的輔助蛋白，參與調(diào)節(jié)DNA的合成，與細(xì)胞增殖、周期密切相關(guān)，是評價(jià)癌細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[15]。高良姜多糖降低了MFC荷瘤小鼠血清VEGF和PCNA水平，該結(jié)果提示高良姜多糖可抑制腫瘤血管新生和腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，高良姜多糖可有效抑制荷瘤小鼠MFC移植瘤生長，對小鼠各器官未產(chǎn)生明顯的毒副作用，其抗腫瘤活性可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤血管的新生和腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。