雒曉芳，許淑娟，潘和平*

1西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部；2西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030

鐵皮石斛是蘭科石斛屬的多年生草本植物。不僅是傳統(tǒng)的珍貴中藥材，也是高檔的觀賞花卉，擁有很高的觀賞價(jià)值。鐵皮石斛含有多種內(nèi)生真菌，但只有一些內(nèi)生真菌能有效地促進(jìn)石斛的生長(zhǎng)發(fā)育，組織、宿主、環(huán)境等因素的影響在組織和宿主中表現(xiàn)出一定的差異[1]。

微生物與植物體相互作用關(guān)系由來已久，大多數(shù)植物體的根、莖、葉中都分布著數(shù)量眾多和種類繁多的微生物[2]。內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分，對(duì)植物具有多方面的積極作用。在生物防治上，植物內(nèi)生菌系統(tǒng)地分布于植物體內(nèi)，有充分的碳源和氮源的供應(yīng)，比暴露于外界的惡劣環(huán)境中更有利于發(fā)揮作用[3]。所以具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值的鐵皮石斛內(nèi)生真菌成為篩選新活性物質(zhì)的重要資源[4-8]。

隨著人們對(duì)天然色素的關(guān)注度不斷提高，現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌、真菌等微生物產(chǎn)生的色素也可以作為天然染料用于紡織品的染色中，成為天然染料的新的一大來源[9-11]。天然色素的色澤不穩(wěn)定，在使用過程中易受多種因素(如光、溫度、氧化、pH值、介電極性等)的影響，并影響褪色和變色，影響其著色效果[12-18]。因此研究色素的穩(wěn)定性具有非常重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)從鐵皮石斛中分離出1株產(chǎn)色素的內(nèi)生真菌，其色素為水溶性胞外色素。以這株產(chǎn)橙紅色色素鐵皮石斛內(nèi)生菌為材料，對(duì)產(chǎn)生橙紅色色素的穩(wěn)定性進(jìn)行初步探究，為該色素進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在云南省普洱市寧洱縣五里坡選取生長(zhǎng)優(yōu)良，表面無病蟲害的仿野生生長(zhǎng)三年以上整個(gè)植株。觀察形態(tài)特征，綠桿“硬腳”，植株莖較圓，與節(jié)部有黑褐色環(huán)狀間隙，萼片和花瓣黃綠色，經(jīng)由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院郭鵬輝老師和實(shí)驗(yàn)教學(xué)部微生物學(xué)分室的雒曉芳老師鑒定為鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：氯霉素0.1 g ，pH為6.0±0.2，麥芽膏粉30 g ，瓊脂15 g蒸餾水1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基(PDA)， pH為6.0：把土豆沖洗干凈，去皮。將200 g切成小塊，加入純水1 L，煮沸半小時(shí)，補(bǔ)純水至1 L。在濾液中加入10 g瓊脂，煮沸后加入20 g糖，溶解(用糖培養(yǎng)霉菌，用葡萄糖作酵母培養(yǎng)物)補(bǔ)水，121分鐘滅菌30 min。

高鹽察氏培養(yǎng)基：氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g ，氯化鈉60 g ，蔗糖30 g ，瓊脂20 g ，蒸餾水1 L， 121 ℃高壓滅菌30 min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 1 g ，酵母膏 2 g，蛋白胨 5 g ，NaCL 5 g ，瓊脂 15 g，加水定容至1 L。調(diào)pH為7.4，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，去離子水定容至1 L。 加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min.。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏1 g ，酵母膏2 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L。調(diào)PH為7.4，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，去離子水定容至1 L。 加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3 試劑

鹽酸、蔗糖、氫氧化鈉、無水乙醇、異丙醇、10%SDS、雙氧水、1X TAE(pH 8.0)、1%氯化汞、亞硫酸鈉、硫酸雙氫鏈霉素、青霉素G鉀 、10 mg/mL Rnase(Sigma)、PCR試劑盒、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液、5%石炭酸水溶液。

2 方法

2.1 菌種篩選

選取新鮮健康的鐵皮石斛植株的根段、莖段和葉片用流水沖洗干凈，按照插片法將切片等距離均勻分別放置于含鏈霉素(50～100 mg/L)和青霉素(100～300 mg/L)的5種固體培養(yǎng)基上(3～4片/皿)，分別為麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。于26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～10天待切片周圍長(zhǎng)成肉眼可見的菌落時(shí)，以平板劃線法分離真菌培養(yǎng)。將初篩后獲得的一株優(yōu)勢(shì)菌種連續(xù)富集培養(yǎng)三次。富集培養(yǎng)均無出現(xiàn)雜菌，繼續(xù)以平板劃線法分離純化菌株，重復(fù)三次。通過肉眼對(duì)培養(yǎng)特征的觀察選擇生長(zhǎng)優(yōu)良的菌株。將所得的單菌株接于斜面上26 ℃培養(yǎng)3～5天后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 真菌鑒定

真菌菌體用液氮研磨后提取總DNA，然后用ITS擴(kuò)增引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(NR) 進(jìn)行比對(duì)，并將序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2.3 色素測(cè)定

2.3.1 色素的提取

用接種環(huán)取活化后的菌絲體于麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基中，在 26 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3～5天。至產(chǎn)生的色素達(dá)到飽和時(shí)除去菌絲體，保留僅存色素的培養(yǎng)基，然后按體積比1∶2(w/v)加入蒸餾水在60 ℃水浴條件下進(jìn)行浸提1 h，經(jīng)過8層紗布過濾掉培養(yǎng)基等大塊的固體雜質(zhì)，用濾紙過濾后37 ℃烘箱干燥得到橙紅色素粗提物。用蒸餾水配制濃度為 1% 的色素溶液作為母液。

2.3.2 色素吸收光譜曲線的測(cè)定

取1%的色素溶液，用G10S UV-VIS雙光束紫外可見分光光度計(jì)在 300～700 nm 范圍內(nèi)掃描，以 10 nm為掃描間隔，記錄數(shù)據(jù)，利用 Excel軟件分析找到最大吸收波長(zhǎng)。測(cè)出的最強(qiáng)吸收峰波長(zhǎng)值將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的參考值。

2.3.3 色素色價(jià)測(cè)定

色價(jià)測(cè)定參照GB 1886.34-2015 “食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑辣椒紅”的方法做了適當(dāng)調(diào)整：準(zhǔn)確稱取0.25 g 色素粗品，精確至 0.000 2 g，用蒸餾水溶解于 25 mL 的容量瓶中，配制成濃度為 1% 的色素溶液，適當(dāng)稀釋使吸光值控制在 0.3 ～ 0.7 范圍內(nèi)，用蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值。色價(jià) E 和色價(jià)保存率計(jì)算公式如下：

2.4 色素的穩(wěn)定性研究

2.4.1 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取適當(dāng)稀釋后的色素溶液，分別置于 4、20、40、60、80、100 ℃ 恒溫水浴鍋中避光保溫 1 h，迅速冷卻至常溫觀察顏色變化，以蒸餾水為對(duì)照分別測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算色素色價(jià)保存率。

2.4.2 pH對(duì)色素的影響

取適當(dāng)稀釋后的色素溶液，分別用 1mol/mL NaOH 和 1mol/mL HCl調(diào)節(jié) pH 為 2、4、6、8、10、12，室溫避光靜置 1 h，觀察顏色變化，分別測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值計(jì)，計(jì)算色素色價(jià)保存率。

2.4.3 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取 5 mL 適當(dāng)稀釋的色素溶液于玻璃皿中，用保鮮膜封口，分別置于自然光照、紫外光照和避光條件下持續(xù)處理 24 h，分別測(cè)定其在3、6、9、12 h時(shí)的最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算色素色價(jià)保存率。

2.4.4 氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取9 mL 適當(dāng)稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的氧化劑 H2O2和濃度為 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的還原劑Na2SO3。室溫避光靜置 1 h，分別測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算色素色價(jià)保存率。

2.4.5 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取9 mL 適當(dāng)稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為1%的5種金屬離子溶液FeCl3、ZnSO4、CuSO4、CaCl2和MnCl2，室溫避光靜置1 h，分別測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算色素色價(jià)保存率。

2.4.6 常見添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取9 mL 適當(dāng)稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl、蔗糖、葡萄糖溶液。室溫避光靜置 1 h，分別測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算色素色價(jià)保存率。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的形態(tài)特征

用5種不同的固體及對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基經(jīng)過初篩、富集培養(yǎng)以及分離純化，得到一株鐵皮石斛優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌，將其命名為X1。菌株 X1菌落在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)26 ℃培養(yǎng)3天，即形成較典型的菌落，菌落呈白色、蛛網(wǎng)狀，無隔。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝為雙輪生或三輪生，?；枯?～3個(gè)，瓶梗每輪4～8個(gè)，分生孢子為橢圓形，壁平滑，分生孢子鏈圓柱狀。

3.2 分子生物學(xué)鑒定

3.2.1 16S rDNA擴(kuò)增

圖1 X1的 PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of X1

Marker條帶組成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp條帶濃度為60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為30 ng/3 μL。電泳方向從下向上。

3.2.2 進(jìn)化樹構(gòu)建

將X1菌株鐵皮石斛內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌的16S rDNA的核酸序列經(jīng)序列用比對(duì)用軟件MEGA5.1進(jìn)行多重比對(duì)并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：X1菌株與鏈孢霉菌屬中的Neurosporaafricana的16S rDNA序列有99%的同源性，可見X1與鏈孢霉菌具有較近的遺傳距離。結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，將X1與鏈孢霉菌屬中的Neurosporaafricana具有較近的遺傳距離。

圖2 X1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Ehylogenetic tree of X1

3.3 色素穩(wěn)定性

3.3.1 不同波長(zhǎng)條件下色素紫外吸收光曲線

圖3 不同波長(zhǎng)下橙紅色色素的OD曲線Fig.3 The OD curve of orange red pigment at different wavelengths

由圖3可知，300～210 nm范圍內(nèi)為下降趨勢(shì)，320～400 nm范圍內(nèi)為持續(xù)上升，至400～700 nm為緩慢下降的趨勢(shì)，故可得最大吸收峰為波長(zhǎng)λ為400 nm。故本實(shí)驗(yàn)選擇400 nm 作為最大吸收波長(zhǎng)。

3.3.2 不同溫度條件對(duì)色素色價(jià)的影響

圖4 不同溫度對(duì)色素色價(jià)的影響Fig.4 The effect of different temperatures on the color color of the pigment

由圖4可知，20～60 ℃時(shí)色素的保存率處于上升階段，60～100 ℃是色素的保存率則處于連續(xù)下降階段，溫度為60 ℃時(shí)其色價(jià)保存率最好為82%即對(duì)色素的影響較小，對(duì)色素有護(hù)色反應(yīng)。所以選擇60 ℃作為該色素的提取溫度。

3.3.3 不同pH值對(duì)色素色價(jià)的影響

圖5 不同pH值對(duì)色素色價(jià)的影響Fig.5 The effect of different pH on the color value of pigment

用 1mol/m L Na OH 和 1mol/m L HCl調(diào)節(jié)經(jīng)稀釋的色素溶液的pH 分別為 2、4、6、8、10、12，室溫放置1 h，取不同pH的1 mL色素溶液測(cè)定吸光度值。由圖5可知，pH為2～8時(shí)的色價(jià)保存率持續(xù)上升，pH在8～12的時(shí)候連續(xù)下降，所以色價(jià)保存率最好為pH=8時(shí)，色價(jià)保存率為56%。說明pH的變化對(duì)色素的色價(jià)影響較大。色素宜儲(chǔ)存于中性或弱堿性環(huán)境，強(qiáng)堿性環(huán)境比酸性環(huán)境對(duì)色素的色價(jià)穩(wěn)定性影響更大。

3.3.4 不同光照條件對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖6 不同光照條件對(duì)色素色價(jià)的影響Fig.6 The effect of different light on the color price of pigment

將10 mL色素溶液放置于自然光、紫外、避光三個(gè)條件下室溫持續(xù)處理12 h。每3 h取1 mL的色素溶液測(cè)定吸光度值。由圖6可知，紫外條件下，0～6 h范圍內(nèi)色素溶液的色價(jià)持續(xù)上升，6～12 h色素溶液色價(jià)持續(xù)下降。自然光條件下，0～3 h色價(jià)先下降，3～6 h色價(jià)上升，6 h后色素溶液色價(jià)持續(xù)下降。避光條件下，對(duì)該色素色價(jià)的影響可忽略不計(jì)。在自然光和紫外條件下， 6 h時(shí)均會(huì)發(fā)生增色反應(yīng)，間接證明紫外對(duì)該色素具有增色反應(yīng)。避光條件下，對(duì)該色素的色價(jià)影響可忽略不計(jì)，可將色素溶液避光保存。

3.3.5 不同濃度H202和Na2SO3溶液對(duì)橙紅色素穩(wěn)定性的影響

圖7 H202和Na2SO3對(duì)色素色價(jià)的影響Fig.7 The effect of H2O2 and Na2SO3 on color value of pigment at different concentrations

由圖7可知，經(jīng)氧化劑H202和還原劑Na2SO3處理后，色素對(duì)H202和Na2SO3溶液較敏感。隨著濃度的上升，整體呈下降趨勢(shì)，對(duì)色素一直保持減色反應(yīng)。

3.3.6 不同金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖8 不同金屬離子溶液對(duì)色素色價(jià)的影響Fig.8 The effect of different metal ion in the solution of the dye color value

由圖8可知，濃度為1%的Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ca2+和Mn2+5種金屬離子溶液對(duì)色素溶液均有不同程度影響。其中，F(xiàn)e3+、Ca2+對(duì)色素溶液具增色反應(yīng)，Zn2+、Cu2+、Mn2+對(duì)色素溶液有保色效果。

3.3.7 不同常見添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由圖9可知，經(jīng)不同濃度NaCl溶液處理后，5%～10%范圍內(nèi)色素色價(jià)呈上升趨勢(shì)，于10%時(shí)色素色價(jià)達(dá)到峰值，10%之后色素溶液色價(jià)持續(xù)下降。經(jīng)不同濃度葡萄糖溶液處理后，5%～15%范圍內(nèi)色素色價(jià)呈上升趨勢(shì)，15%時(shí)色素色價(jià)達(dá)到峰值，15%～25%色素溶液色價(jià)持續(xù)下降。不同濃度的蔗糖對(duì)該色素的色價(jià)幾乎沒有影響。

圖9 不同常見添加劑對(duì)色素色價(jià)的影響Fig.9 The effect of different common additives on color Price of pigments

4 討論

內(nèi)生真菌(endophytic fungi) 指長(zhǎng)期生活在植物的根、莖、葉等器官的組織內(nèi)部，但一般不引發(fā)植物體病害的真菌。鏈格孢是經(jīng)濟(jì)上重要的真菌屬之一。大多數(shù)種類兼性寄生于植物上， 引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害，造成田間和產(chǎn)后損失。有幾個(gè)鏈格孢小孢子種可侵染人和動(dòng)物， 引起皮癬、甲癬、顎骨髓炎等疾病。鏈格孢產(chǎn)生的某些真菌毒素是重要的致癌因素。另一方面， 鏈格孢也是有應(yīng)用潛力的生物資源， 如一些鏈格孢次生代謝物具有殺蟲、殺菌和殺原生生物活性。長(zhǎng)柄鏈格孢中某些菌株分生孢子壁中含有激發(fā)子組份， 可被用來制成防治煙草赤星病的生防制劑等[19]。X1菌株與脈孢菌中的Neurosporaafricana親源關(guān)系最近，為99%。脈孢菌屬在遺傳研究及生化途徑研究上廣泛應(yīng)用，且其菌體內(nèi)含豐富蛋白質(zhì)、維生素B12等，可用于工業(yè)發(fā)酵和制作飼料。

發(fā)現(xiàn)并選擇能夠大量生產(chǎn)色素的真菌，作為一種新型的天然染料應(yīng)用與紡織品的染色中，利用真菌培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)對(duì)于色素進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，將有望解決天然植物染料不能滿足人們的需求的難題，使得天然染料更好的為人們使用[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇X1內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的橙紅色色素對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行初期研究。經(jīng)研究分析，發(fā)現(xiàn)該水溶性橙紅色色素色價(jià)保存率易受到批次影響，不同批次的1%色素溶液色價(jià)均有差異。并且也發(fā)現(xiàn)該色素溶液不能低溫保存，低溫保存對(duì)其色價(jià)有很大影響。每次提取配制的色素溶液，只可以于常溫避光放置一周。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)通過多個(gè)單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)橙紅色色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為色素進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。