齊海艷，陳新蕊，王詩寒，杜 妍，裴月湖,*，甘春麗*

1沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽110016；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150081

隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展和人口老齡化進程的加快，血栓性疾病[1]已成為嚴(yán)重危害人類生命健康的頭號疾病，常見的如心絞痛 、心肌梗死、腦梗死、血栓性靜脈炎等，而且日趨嚴(yán)重。治療和干預(yù)血栓性疾病成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的重點和熱點之一，其病因及發(fā)病機制十分復(fù)雜，尚未完全闡明。目前認(rèn)為血小板聚集[2]是引起血栓性疾病關(guān)鍵因素之一。到現(xiàn)在為止，國際上預(yù)防和治療血栓的常用藥物包括抗血小板藥物，如阿司匹林；抗凝血藥物，如華法林等；纖維蛋白溶解藥物，如尿激酶(UK)等。

紫錐菊(Echinaceapurpurea(L.) Moench)也稱“松果菊”，為菊科(Compositea)松果菊屬(Echinacea)多年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲，已在我國引種成功[3]。紫錐菊提取物具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抑制念球菌感染、預(yù)防光照損傷皮膚等作用[4]。目前還有藥理研究表明[5,6]，紫錐菊中酚酸類化合物具有不同程度的抗血小板聚集的活性。紫錐菊中的菊苣酸等成分其抗血栓作用至今沒有研究報道。

目前對抗血栓的研究主要采用的是經(jīng)典的體外抗凝血及抗血栓方法[7-12]，以血漿復(fù)鈣時間、凝血酶時間、體外血栓溶解率及全血凝塊容積率為指標(biāo)，考察化合物體外抗凝血與抗血栓的活性。由于在體內(nèi)凝血過程中，需要血小板和一系列凝血因子的共同參與，血小板為凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅸa、Ⅹa提供了磷脂表面，在Ca2+參與下激活凝血酶原激活物，進而激活凝血酶，完成凝血過程。在此基礎(chǔ)上，本實驗采用了Born比濁法[13,14]研究10個酚酸類化合物以及紫錐菊提取物體外抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用，并應(yīng)用了分子對接的方法[15,16]，將酚酸類化合物與凝血因子進行對接。實驗旨在研究紫錐菊酚酸類化合物及其提取物體外抗血小板聚集活性以及酚酸類化合物與凝血因子的虛擬分子對接，為紫錐菊提取物體內(nèi)抗血小板聚集活性的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

雄性SD大鼠(動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001)，體重220 ± 10 g，動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度21± 2 ℃，濕度40%～45%，自由攝食和飲水，由沈陽藥科大學(xué)動物中心提供。

1.1.2 試劑與藥品

乙醇(分析純，天力化學(xué)有限公司)；戊巴比妥鈉(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；枸櫞酸鈉(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；阿司匹林(ASA)(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(分析純，富宇精細(xì)化工有限公司)；紫錐菊藥材粗粉(益康中藥堂)；4,5-腺苷二磷酸二鈉鹽(ADP)(分析純，美國sigma公司)。

化合物S-1～S-10均由本實驗室前期合成所得[17]，經(jīng)過TLC、MS、1H NMR、13C NMR鑒定(如表1所示)。

表1 10個酚酸類化合物的化學(xué)名稱及其結(jié)構(gòu)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號Number名稱Name結(jié)構(gòu) StructureS-8咖啡酸甲酯Methyl caffeateS-9咖啡酸乙酯Ethyl caffeateS-10綠原酸Chlorogenic acid

1.1.3 儀器與材料

HHS型電熱恒溫水浴鍋(博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；LC-400低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；HC-2518R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；LG-KOALA血小板凝集儀(北京Steellex科學(xué)儀器公司)；AGBP210S電子天平(德國Satorius公司)。

1.2 方法

1.2.1 富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備

未給藥雄性SD大鼠，給予戊巴比妥鈉 (50 mg/kg，i.p.0.08 mL/100 g)進行麻醉，右側(cè)頸動脈取血5 mL，采用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，全血與3.8%枸櫞酸鈉水溶液比例為9∶1(v/v)混合。800 rpm離心10 min，取上層血漿，得到PRP，3 000 rpm繼續(xù)離心10 min，取上層血漿，得到PPP。

1.2.2 供試品溶液的制備

取合成的酚酸類化合物S-1～S-10及ASA對照品適量，精密稱量，DMSO溶解，配制成2、20、200 μmol/L的樣品溶液,作為供試品溶液。

紫錐菊藥材粗粉10 g加入50 mL 60%乙醇回流提取三次，每次30 min，合并提取液，濃縮，用DMSO溶解，配制成每1 mL含1 g的生藥儲備液，稀釋成100、50、10 mg/mL三個濃度梯度，測定前用0.45 μm濾膜過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.2.3 體外抗血小板聚集實驗

將290 μL PRP加入比濁杯中，放入攪拌珠，分別加入5 μL DMSO以及供試品溶液，于37 ℃預(yù)溫口內(nèi)預(yù)溫1 min，之后加入ADP 5 μL(終濃度5 μmol/L)，37 ℃攪拌5 min，記錄最大血小板聚集率。以DMSO溶液作為空白對照溶液，以ASA溶液作為陽性對照溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

血小板聚集百分率及聚集抑制百分率計算公式如下：

聚集率(%)=(PPP透光度-PRP聚集透光度)/PPP透光度×100%

聚集抑制率(%)=(溶劑對照組聚集率-給藥組聚集率)/溶劑對照組聚集率×100%

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對聚集抑制率進行線性相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗數(shù)據(jù)取三次獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值。

采用Sigma Plot線性回歸方程計算供試品的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)，結(jié)果以x±SD表示。

1.4 酚酸類化合物與凝血因子分子對接

采用Discovery Studio 3.5以及RCSB Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫在建立對接體系的基礎(chǔ)上模擬10種酚酸類化合物與凝血因子F5、F8、F11分子間的結(jié)合鍵和對接能。

2 結(jié)果

2.1 紫錐菊及其酚酸類化合物體外抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集活性

2.1.1 紫錐菊提取物體外抗血小板聚集活性

線性相關(guān)分析相關(guān)系數(shù)r=0.89，t=4.344 5(P<0.05)，紫錐菊提取物濃度與聚集抑制率存在線性相關(guān)關(guān)系。紫錐菊60%乙醇提取物對體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用，抑制率呈濃度依賴性(見表2)。

2.1.2 酚酸類化合物外抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集活性

體外實驗結(jié)果顯示：化學(xué)法合成的酚酸類化合物均具有抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性，其中3個化合物抗血小板聚集的作用與ASA抗血小板聚集的作用相近，實驗結(jié)果見表3。

表2 紫錐菊提取物體外抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性(n=3)

注:與陽性對照相比，P<0.05。

Note:Ratio of positive control,P<0.05.

表3酚酸類化合物體外抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性(n=3)

Table 3 Effects of phenolic compounds on the platelet aggregations induced by adenosine diphosphate (ADP)invitro(n=3)

化合物Compound半數(shù)抑制濃度IC50 (μmol/L)(x ± SD)化合物Compound半數(shù)抑制濃度IC50 (μmol/L)(x ± SD)ASA8.2 ± 0.1S-615.6 ± 1.3S-19.2 ± 1.2S-714.4 ± 2.1S-210.3 ± 0.8S-825.2 ± 2.2S-311.1 ± 1.5S-919.8 ± 1.9S-416.2 ± 0.9S-1013.7 ± 0.6S-522.7 ± 0.4

注:與陽性對照相比，P<0.05。

Note:Ratio of positive control,P<0.05.

2.2 酚酸類化合物與凝血因子分子對接

2.2.1 酚酸類化合物與F5蛋白對接

酚酸類化合物以及陽性藥，分別與F5蛋白在相同的條件下進行分子對接，得到對接結(jié)果(見圖1)以及對接評估數(shù)據(jù)(見表4)。

圖1 酚酸類化合物與F5分子的對接結(jié)果Fig.1 Molecular docking results of phenolic compounds and F5

以D-苯丙氨酸-N-[(2S,3S)-6-{[氨基(亞胺基)甲基]氨基}-1-氯-2-羥基己酸-3-基]-l-脯氨酰胺[18]作為陽性藥，與F5進行分子對接，結(jié)果顯示化合物可以全部進入到活性位點。陽性藥與活性位點氨基酸Asp562(1個)、Gly566(1個)、Ser568(1個)、Ser589(1個)以及Gly591(2個)可以形成6個氫鍵，具體見表4。同時化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)位于整個活性位點，使得陽性藥與F5蛋白緊密結(jié)合在一起，具體見圖2。

圖2 F5與Positive分子對接結(jié)果分析Fig.2 Evaluation of docking results of Positive and F5注：a.左側(cè)為化合物與活性位點的結(jié)合方式；b.右側(cè)為影響結(jié)合的因素：綠色虛線表示氫鍵，橘黃色表示共價鍵。Note:a.The combination of the Positive and the active site;b.Factors for binding:green represents hydrogen bond,orange is covalent bond.

比較化合物與陽性藥的對接結(jié)果，化合物S-6對F5的作用要比陽性藥好，原因是化合物S-6化學(xué)結(jié)構(gòu)位于整個活性位點，且與活性位點氨基酸Trp455(1個)、Asp562(2個)、Ser589(1個)及Gly591(2個)形成6個氫鍵，使得S-6與F5蛋白緊密結(jié)合(見圖3,表4)。

圖3 F5與S-6分子對接結(jié)果分析Fig.3 Evaluation of docking results of S-6 and F5

表4 化合物S-6和陽性對照藥分別與F5形成氫鍵的氨基酸及氫鍵數(shù)目

注：-：無氫鍵；+：1個氫鍵；++：2個氫鍵

Note:-:no hydrogen bond;+:1 hydrogen bond;++:two hydrogen bonds

表5 酚酸類化合物與F5對接結(jié)果評價

化合物S-2、S-4、S-7、S-8、S-10與F5結(jié)合的能力要高于與陽性藥結(jié)合能力的50%，而S-1、S-3、S-9的結(jié)合能力較小(見表5)，結(jié)合的氫鍵情況見表6。

表6 酚酸類化合物與F5形成氫鍵的氨基酸及氫鍵數(shù)目

2.2.2 酚酸類化合物與F8,F11對接

化合物與凝血因子VIII(F8)和凝血因子XI(F11)的分子對接方法同上。F8的陽性藥為(2R)-1-(2,4-苯氧基苯基)-3-[(2E)-2-亞氨基-3-(2-哌啶-1-乙基)-2,3-二氫-1H-苯并咪唑-1-基]丙-2-醇[19]、F11的陽性藥為6-氨基甲?；?N-苯基-4-(嘧啶-2-氨基)萘-2-甲酰胺[20]，得到F8(圖4)和F11(圖5)對接結(jié)果。

圖4 酚酸類化合物與F8分子的對接結(jié)果Fig.4 Molecular docking results of phenolic acid compounds and F8

由上述表和圖可知，同陽性藥相比較，化合物S-5和S-6與F8或者F11的作用都比陽性藥強，其余藥物的作用均超過陽性藥的50%，尤其是S-6能夠更好的與F5結(jié)合。

3 結(jié)論

在凝血過程中，凝血因子與血小板關(guān)聯(lián)緊密，協(xié)同完成凝血過程。為了更好的研究酚酸類化合物的抗血栓作用，本實驗進行了體外抗血小板與凝血因子的分子對接兩方面研究。

表7 化合物與Coagulation factorVIII(F8)對接結(jié)果評價

表8 化合物與Coagulation factorXI(F11)對接結(jié)果評價

圖5 酚酸類化合物與F11分子的對接結(jié)果Fig.5 Molecular docking results of phenolic compounds and F11

從體外實驗結(jié)果看，檢測的幾種天然酚酸類化合物及合成中間體都顯現(xiàn)出了抗血小板聚集作用(略低于對照藥ASA)，就半數(shù)抑制濃度IC50來說，含有游離羧基的酚酸類活性普遍好于成酯化產(chǎn)物，可見羧基的游離對活性是重要的。這可能與羧基和血小板聚集過程中破壞膜表面電荷有關(guān)，亦或是增加了特定靶點的結(jié)合力。

另一方面，酚羥基的存在對活性的提高作用較大，但不能得出鄰二酚羥基的存在使活性可能低于單個酚羥基化合物。分析酚羥基的存在，可與過氧自由基迅速反應(yīng)，避免血小板活化，是其抗血小板聚集的機制之一。

結(jié)合體外實驗結(jié)果，采用分子對接方法，選擇與血小板凝聚相關(guān)的蛋白(F5、F8、F11)為靶點，對這些化合物進行虛擬對接。發(fā)現(xiàn)S-1～S-10均可以與靶點以氫鍵的方式結(jié)合，其中靶點與部分化合物的相互結(jié)合能可高于與陽性對照物的50%。提示這些化合物可能參與到血小板聚集的過程中，發(fā)揮抑制作用。化合物S-6與靶點的結(jié)合位點更多，結(jié)合更緊密，結(jié)合能力更強，選擇性更好，有望成為具有抗血小板聚集作用的先導(dǎo)物。

體外實驗結(jié)果顯示不能代表體內(nèi)實驗結(jié)果。因此，課題延續(xù)工作將圍繞建立系統(tǒng)方法考察紫錐菊中幾種天然酚酸類化合物抗血小板聚集活性，探討作用機制，為篩選出療效更好、副作用更小、生物利用度更高的治療血栓栓塞性疾病藥物奠定基礎(chǔ)。

紫錐菊提取物及其酚酸類化合物在體外均顯現(xiàn)出抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性，其中菊苣酸(S-6)抗血小板聚集活性較佳。分子對接研究顯示菊苣酸(S-6)與凝血因子(V、VIII、XI)結(jié)合能力強于所用的三種陽性對照藥，有望成為治療血栓栓塞性疾病新藥的先導(dǎo)化合物。