袁志鷹，羅林明,陳乃宏, ， 梁 晟，周小江*，黃惠勇*，陳妍羽

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)；2湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化與功能工程技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410208；3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京100050；4湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙 410001

百合(Liliibulbus)為多年生草本植物，始載于漢朝《神農(nóng)本草經(jīng)》，2015版《中國(guó)藥典》收錄為卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、百合(LiliumbroumiiF.E.Brown var.viridulumBaker)、細(xì)葉百合(LiliumpumilumDC.)3個(gè)品種[1～2]。百合藥用部位主要為鱗莖及其珠芽(百合子)，百合鱗莖研究報(bào)道較多，而百合珠芽由于研究較少，資源浪費(fèi)嚴(yán)重?，F(xiàn)代研究顯示，百合珠芽中含有黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)和生物堿等多種活性成分，具有抗氧化的生物活性[3]。

目前分析百合鱗莖、珠芽中化學(xué)成分的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4,5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等方法[7]，其中HPLC法操作簡(jiǎn)便，目前主要用來(lái)測(cè)定百合鱗莖中酚酸甘油酯、沒(méi)食子酸等成分。GC-MS法主要用于分析百合鱗莖中揮發(fā)性成分，具有一定的局限性。HPLC-Q-TOF-MS法靈敏度高，并且可以用來(lái)鑒定復(fù)雜基質(zhì)中的化學(xué)成分[8,9]，但分析速度一般。UPLC-Q-TOF-MS法具有快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)，成為中藥分析領(lǐng)域重要技術(shù)手段[10-12]。目前，采用UPLC-Q-TOF-MS法快速分析百合珠芽中化學(xué)成分尚未見(jiàn)于報(bào)道。近年來(lái)，腫瘤已成為中國(guó)死亡率最高的疾病之一[13]，而薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，可顯著抑制肺癌A549、NCI-H460和NCI-H446細(xì)胞增殖，在體外具有較強(qiáng)的抗肺癌作用[14]，同時(shí)還能明顯抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[15,16]。薯蕷皂苷水解即可得到薯蕷皂苷元，而目前采用CCK8法研究薯蕷皂苷元抗肺腫瘤A549細(xì)胞、胃腫瘤HGC-27細(xì)胞的藥效篩選以及百合珠芽中是否含有薯蕷皂苷尚未見(jiàn)報(bào)道，值得我們?nèi)ヌ接憽?/p>

本試驗(yàn)在前期對(duì)百合鱗莖研究的基礎(chǔ)上，采用UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)可快速分析鑒定百合珠芽中主要化學(xué)成分，并采用CCK-8法進(jìn)行薯蕷皂苷元腫瘤細(xì)胞增殖分析研究，對(duì)百合珠芽產(chǎn)品生產(chǎn)、加工和利用具有深層次指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

202型電熱恒溫干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTof/MS(美國(guó)Waters 公司)；Agilent UPLC 2010(安捷倫科技公司)；METTLER TOLEDO ML204電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，KM-250DE臺(tái)式超聲波清洗儀(昆山美美超聲儀器有限公司)，80-1型電動(dòng)離心機(jī)(城西曉陽(yáng)電子儀器廠)；96孔板(美國(guó)corning公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、超凈臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、ELx 800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek 公司)。

1.2 藥品與試劑

百合珠芽采于湖南龍山和順百合種植基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周小江教授鑒定為百合科植物卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)的珠芽部分。薯蕷皂苷元(B2117，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，德國(guó)默克公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)默克公司)，王百合苷A(0252-DT01，上海standard 科技公司)。人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人胃癌細(xì)胞HGC-27、人肺癌細(xì)胞A549(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；高糖DMEM培養(yǎng)基、FBS、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美國(guó)Gibco 公司)；順鉑(CDDP，美國(guó)Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；青霉素鏈霉素(美國(guó)HyCLone公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF-MS分析百合珠芽中化學(xué)成分

2.1.1 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%乙酸，梯度洗脫，流速：0.2 mL/min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)：309 nm，進(jìn)樣體積：2.00 μL。采用UPLC-MS/MS(正離子、負(fù)離子模式)，離子化方式：電噴霧離子化(ESI)，ESI-毛細(xì)管電壓 2.8 kV，錐孔電壓28 V，錐孔氣流50 L/h；ESI+毛細(xì)管電壓 3.0 kV，錐孔電壓30 V，錐孔氣流50 L/h。ESI+，ESI-離子化干燥氣溫度均為：T=350 ℃，V=600 L/h。流動(dòng)性梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.1.2 供試品溶液的制備

將采集的百合新鮮珠芽，洗凈，再放入60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中60 min，得干百合珠芽，粉碎過(guò)100目，精密稱(chēng)定過(guò)篩的樣品1.0 g至量瓶中，加入50 mL 80%乙醇，用超聲儀提取40 min。冷卻至室溫，精密稱(chēng)定，補(bǔ)足80% 乙醇，濾過(guò)，濾液旋蒸至干，加入10 mL 80% 乙醇溶解過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，既得。

以國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，單因子污染指數(shù)評(píng)價(jià)法可用于評(píng)價(jià)土壤重金屬污染程度，分析土壤環(huán)境質(zhì)量對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響程度。具體分級(jí)指標(biāo)為：P綜≤0.7，土壤環(huán)境質(zhì)量處于清潔安全狀態(tài)；P綜 1時(shí)，表明土壤重金屬含量超標(biāo)污染，對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育有影響，進(jìn)而會(huì)通過(guò)食物鏈影響人體的健康；1 3為重度污染。

表1 梯度洗脫程序表

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密平行稱(chēng)取2份王百合苷A標(biāo)準(zhǔn)品適量，用80%乙醇溶解，稀釋配制成0.556、0.68 mg/mL的王百合苷A對(duì)照品溶液。

2.1.4 超聲提取優(yōu)化試驗(yàn)

按2.1.2項(xiàng)下方法得到干百合珠芽，精密稱(chēng)定1.0 g干百合珠芽粉至量瓶中， 加入50 mL 80%乙醇，用超聲儀在不同提取時(shí)間條件下(10、20、30、40、50 min)處理后，冷卻至室溫，精密稱(chēng)定，補(bǔ)足80% 乙醇，搖勻過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，既得待測(cè)液。在前期研究中，課題組發(fā)現(xiàn)與其他成分比較，百合珠芽中王百合苷A含量較高，因此選用王百合苷A的提取率作為百合珠芽藥材的化學(xué)成分提取考核指標(biāo)。將待測(cè)液注入Agilent UPLC 2010，測(cè)定王百合苷A的含量。王百合苷提取率計(jì)算方法：提取率(%)= 提取液濃度 ×體積 /原料質(zhì)量 × 100%。

2.2 薯蕷皂苷元抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱內(nèi)取出需要復(fù)蘇的肺癌A549細(xì)胞，置于恒溫水浴鍋內(nèi)37 ℃快速解凍，用移液槍迅速將凍存管內(nèi)的解凍后的細(xì)胞液移至含4 mL 的10% FBS、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)DMEM完全培養(yǎng)液的15 mL離心管中，以800 rpm速率離心5 min，上清液棄去，加入6 mL DMEM完全培養(yǎng)液，混勻，將細(xì)胞液移至100 mm培養(yǎng)皿中，晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞液均勻分散，置于含5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)3～4天傳代1次。

2.2.2 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，然后在96孔板中按100 μL/孔的比例接種細(xì)胞懸液(8.0×104～1.0×105個(gè)/mL)，將培養(yǎng)板放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.2.2.2 加藥干預(yù)

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，吸出舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 無(wú)血清含雙抗DMEM培養(yǎng)液，饑餓12 h后去掉培養(yǎng)液，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入事先配置好的含不同濃度待測(cè)藥物的DMEM完全培養(yǎng)液，溶劑對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加入含4 μg/mL CDDP的完全培養(yǎng)液，每孔100 μL，每組設(shè)置5個(gè)副孔。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2.2.3 加入CCK-8顯色

取出培養(yǎng)板，吸棄每孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液，避光加入CCK-8溶液與含雙抗DMEM培養(yǎng)液，以10∶100比例新鮮配置的顯色液，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育0.5～1.0 h。

2.2.2.4 檢測(cè)吸光值

將處理好的培養(yǎng)板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，在波長(zhǎng)為450 nm處的檢測(cè)其OD值。

2.2.2.5 計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率

根據(jù)每組測(cè)得的OD值，計(jì)算出藥物對(duì)受試細(xì)胞的增殖抑制率。計(jì)算方法如下：

增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

3 結(jié)果與討論

3.1 超聲提取條件的選擇

進(jìn)行了超聲提取10、20、30、40、50 min的比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)40、50 min效果最佳，二者提取效率相當(dāng)，故將超聲提取時(shí)間設(shè)定為40 min。具體見(jiàn)表2。

3.2 液相色譜條件優(yōu)化

對(duì)樣品超聲提取液進(jìn)行UPLC-DAD測(cè)定，結(jié)果為309 nm時(shí)百合珠芽中多種有效成分有較大吸收峰，故選擇百合珠芽定性分析檢測(cè)波長(zhǎng)為309 nm，(見(jiàn)圖1)。同時(shí)考察了thermo C18(100 mm×2.1mm，1.5 μm)，Agilent C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，waters acquity UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)， 3 種色譜柱的峰形、柱效和分離度，結(jié)果顯示，以thermo C18為最佳，這有利于質(zhì)譜定性分析。

表2 不同超聲提取時(shí)間下的王百合苷A提取效率

圖1 百合珠芽液相色譜圖(309 nm)Fig.1 Chromatography of lily bulbil(309 nm)

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)用UPLC圖無(wú)法很好地分離鑒定百合珠芽中復(fù)雜的化學(xué)成分。但是采用二級(jí)質(zhì)譜離子流圖可以較好地分離百合珠芽中主要化學(xué)成分。質(zhì)譜條件的選擇：ESI+模式下，毛細(xì)管電壓從2.5 kV～3.5 kV，錐孔電壓從20 V～40 V；ESI-模式下，毛細(xì)管電壓從2.0 kV～3.2 kV，錐孔電壓從20 V-35 V進(jìn)行選擇。最后發(fā)現(xiàn)，在ESI-模式下，毛細(xì)管電壓 2.8 kV，錐孔電壓28 V；ESI+模式下，毛細(xì)管電壓 3.0 kV，錐孔電壓30 V，TIC圖得到的有效信息較多。

實(shí)驗(yàn)采用正、負(fù)離子模式同時(shí)掃描樣品，其中在負(fù)離子模式條件下，王百合苷A、王百合苷B、王百合苷C、王百合苷E、王百合苷F、1-O-p-香豆酰甘油、1-O-阿魏酰香-3-O-p-豆酰甘油色譜峰響應(yīng)值較高，而在正離子模式條件下，對(duì)香豆酸、槲皮素、薯蕷皂苷色譜峰響應(yīng)值較高，為增大物質(zhì)推測(cè)的可靠性，實(shí)驗(yàn)選用正、負(fù)離子模式同時(shí)測(cè)定樣品，最大程度地獲取質(zhì)譜信息，見(jiàn)圖2～3。

3.4 化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS鑒定

在擬定分析條件下，電噴霧電離源正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)色譜流出物進(jìn)行檢測(cè)，四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)各主要色譜峰進(jìn)行歸屬，通過(guò)一、二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，根據(jù)其反相色譜保留行為、紫外檢測(cè)和質(zhì)譜特征，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。在負(fù)離子模式下，共推測(cè)鑒定出7個(gè)化學(xué)成分；在正離子模式下，共推測(cè)鑒定出3個(gè)化學(xué)成分。具體質(zhì)荷比和碎片離子信息見(jiàn)表3。

圖2 二級(jí)質(zhì)譜離子流圖(正離子模式)Fig.2 Daughter ion flow graph of the MS-MS spectrogram in positive ion modes注：t=21.18 min，對(duì)香豆酸；t=24.21 min，槲皮素；t=27.39 min，薯蕷皂苷。Note:t = 21.18 min,p-coumaric acid;t = 24.21 min,quercetin;t = 27.39 min,dioscin.

圖3 二級(jí)質(zhì)譜離子流圖(負(fù)離子模式) Fig.3 Daughter ion flow graph of the MS-MS spectrogram in negative ion modes 注：t=20.67 min，王百合苷C；t=21.52 min，王百合苷A；t=21.79 min，1-O-p-香豆酰甘油；t=21.82 min，王百合苷F；t=22.2 min，王百合苷E；t=22.85 min，王百合苷B；t=25.08 min，1-O-阿魏酰香-3-O-p-豆酰甘油。Note:t = 20.67 min,regaloside C;t = 21.52 min,regaloside A;t = 21.79 min,1-O-p-coumaroylglycerol;t = 21.82 min,regaloside F;t = 22.2 min，Regaloside E；t = 22.85 min,regaloside B;t = 25.08 min,1-O-feruloyl-3-O-p-coumaroylglycerol.

3.5 薯蕷皂苷元(Dio)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

3.5.1 Dio對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響

Dio在濃度范圍5～100 μM對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖具有弱抑制作用，其抑制率在8.11～15.03 %范圍內(nèi)。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

3.5.2 Dio對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

5～100 μM Dio對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖具有抑制作用，其抑制率在11.04～30.59%范圍內(nèi)，其中25～100 μM濃度組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。具體結(jié)果見(jiàn)表5。

4 結(jié)論

本文建立了百合珠芽中主要化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS鑒定方法，方法快速簡(jiǎn)便，能為百合珠芽的質(zhì)量控制及標(biāo)志性成分分析提供技術(shù)參考。本文通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS鑒定出了百合珠芽中薯蕷皂苷等10種化學(xué)成分，證實(shí)了百合珠芽中含有薯蕷皂苷，而薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，水解即可得到薯蕷皂苷元。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了薯蕷皂苷元抗腫瘤藥效實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖只有微弱的抑制活性，而對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值約為62786μM，并且展現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。因此，有必要對(duì)百合珠芽化學(xué)成分進(jìn)行深層次的藥效研究，課題組將繼續(xù)對(duì)鑒定出來(lái)的其他物質(zhì)進(jìn)行藥效試驗(yàn)研究，為更好利用百合資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表3 百合珠芽UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果

表4 Dio對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note:compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

表5 Dio對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note:compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.