楊 慧，陳德經(jīng),2*，夏冬輝，韓 豪,2，陳海濤

1陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院；2陜西理工大學(xué)，陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；4漢中龍?chǎng)F生物工程股份有限公司，漢中 723001

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱“娃娃魚(yú)”，屬有尾目、隱鰓鯢科，是魚(yú)類和爬行動(dòng)物之間的代表兩棲類過(guò)渡類型，有“生物界活化石”的美稱[1]，其機(jī)體中含有多種天然活性物質(zhì)，在藥用、保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用方面具有獨(dú)特的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。近年來(lái)，人們對(duì)大鯢研究主要集中在大鯢肉[3]和大鯢黏液[4]等方面，尚未對(duì)大鯢皮膚黑色素開(kāi)展相關(guān)研究。黑色素是酚類或吲哚類物質(zhì)通過(guò)氧化聚合形成的高分子生物色素，其不溶于水、酸和常見(jiàn)的有機(jī)溶劑，可溶于氫氧化鈉、三乙胺等堿性溶液[5]。動(dòng)物黑色素有真黑色素和脫黑色素兩類，前者不含硫，呈棕色或黑色；后者含硫，呈黃色或微紅棕色。天然黑色素具抗紫外、抗氧化、抗菌、提高免疫力[6-9]功效，可應(yīng)用于化妝品、天然染發(fā)劑、食品添加劑和藥品等領(lǐng)域。

目前，動(dòng)物黑色素的提取方法主要有高速離心法[10]、酸/堿水解法[11]、酶法[12]和堿溶酸沉法[13]。提取和制備方法的不同會(huì)對(duì)黑色素結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生不同程度的影響，要獲得高純度的黑色素，就要最大限度的去除色素以外的其它物質(zhì)。酶解可去除蛋白質(zhì)，堿溶酸沉可去除黑色素中其它不被酶解的雜質(zhì)，得到純度較高的色素。

本實(shí)驗(yàn)利用酶法和堿溶酸沉法制備大鯢皮膚黑色素，以大鯢皮黑色素的提取率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化黑色素提取的工藝條件。利用紫外-可見(jiàn)光譜儀、紅外光譜儀和超高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定大鯢皮膚黑色素的組成成分，并測(cè)定其抗氧化性，為大鯢皮黑色素的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：大鯢皮，漢中龍?chǎng)F生物工程股份有限公司提供。

試劑：維生素C，GR(天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心)；三乙胺，GR(天津市富宇精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心)；硫酸亞鐵、水楊酸，GR(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司)；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷，GR(上海源葉生物科技有限公司)；木瓜蛋白酶，酶活力1000 U/mg(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；溴化鉀，色譜純(天津天光光學(xué)儀器有限公司)；甲醇、甲酸，色譜純(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。

儀器：UPLC-TQD超高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters)；BRUKER VERTEX 70 紅外光譜儀(德國(guó)布魯克有限公司)；UV-1750 型紫外可見(jiàn)分光光度儀(日本島津儀器公司)；LC-800低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；JA5003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；601超級(jí)水浴鍋(金壇市瑞華儀有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鯢皮膚色素提取及純化工藝

將大鯢皮置于6%NaCl中浸泡60 min后轉(zhuǎn)入0.1%檸檬酸溶液中脫色，45 ℃水浴90 min后刮取色素，而后加入5%木瓜蛋白酶，55 ℃酶解4 h后離心，棄上清液。用石油醚反復(fù)溶解沉淀物3次以除去色素中的脂肪，抽濾后真空干燥沉淀物。然后稱取沉淀物，加入氫氧化鈉溶液浸提一段時(shí)間后，離心，取上清液，用6 mol/L HCl溶液調(diào)pH至1.0，靜置后4 000 rpm離心10 min，所得沉淀物即為黑色素粗提物。將黑色素粗提物按以上堿溶、酸沉步驟反復(fù)進(jìn)行3次后，用乙醇、蒸餾水洗滌后，40 ℃真空干燥即得大鯢黑色素純品，計(jì)算提取率。

提取率=黑色素純品質(zhì)量/刮取色素質(zhì)量×100%

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取大鯢皮色素1 g，設(shè)定氫氧化鈉濃度6%、料液比1∶15、提取溫度45 ℃為固定值，分別考察不同氫氧化鈉濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)和提取溫度(35、40、45、50、55 ℃)對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響，提取時(shí)間均為30min。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以大鯢皮膚黑色素提取率為指標(biāo)，確定最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.4 大鯢皮色素定性分析

1.2.4.1 紫外-可見(jiàn)光譜法

取大鯢皮色素于0.01%氫氧化鈉溶液中，震蕩混勻后置于超聲清洗器中超聲30 min，制得大鯢皮色素溶液。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定200～800 nm大鯢皮色素溶液的吸光值，繪制吸光值隨波長(zhǎng)變化的曲線圖。

1.2.4.2 紅外光譜法

溴化鉀壓片法：將烘干的溴化鉀置于瑪瑙缽體中研成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱取150 mg溴化鉀粉末兩份，一份與1 mg純化后色素樣品研細(xì)混勻，另一份作為空白，分別壓片。用紅外光譜儀測(cè)定4 000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)的透過(guò)率。

1.2.4.3 UPLC-MS/MS法

樣品制備：取純化的大鯢皮黑色素10 mg溶解于1%三乙胺-50%甲醇混合溶液中，用混合液定容至25 mL，然后過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，用UPLC-MS/MS測(cè)定。

色譜條件：ACQUITY BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速：0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相甲醇和1%甲酸水溶液(兩者體積比5∶95)；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

質(zhì)譜條件：MS掃描；電離模式：ESI掃描方式，負(fù)離子掃描；脫溶劑氣流：600 L/h；脫溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：110 ℃；毛細(xì)管電壓：3 KV。

1.2.5 大鯢皮色素抗氧化性

1.2.5.1 清除超氧陰離子自由基

取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL，加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)4.5 mL，在25 ℃水浴10 min后，加入3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL混勻，在25 ℃水浴5 min，最后加入8 mmol/L HCl終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定其吸光度值，以4% NaOH溶液調(diào)零，維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定吸光度值3次。按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為不加樣品溶液，加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A1為加入樣品溶液和鄰苯三酚的溶液吸光度；A2為加入樣品溶液但不加鄰苯三酚的溶液吸光度。

1.2.5.2 清除羥基自由基

向試管中加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL，9 mmol/L硫酸亞鐵2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，最后加入9 mmol/L雙氧水2 mL啟動(dòng)反應(yīng)，震蕩混勻，37 ℃水浴保溫30 min，冷卻至室溫后離心(5 000 rpm，10 min)，取上清液在波長(zhǎng)510 nm處每隔30 s測(cè)定其吸光度值，以4% NaOH溶液調(diào)零，維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定吸光度值 3 次。按下式計(jì)算羥自由基的清除率。

式中：A0為不加樣品溶液，加入水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度；A1為加入樣品溶液和水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度；A2為加入樣品溶液但不加水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 氫氧化鈉濃度對(duì)提取率的影響

氫氧化鈉濃度對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響見(jiàn)圖1。由圖 1 可知，隨著NaOH濃度的增大，黑色素的提取率逐漸升高，當(dāng)濃度為1.5 mol/L時(shí)，提取率最高為0.93%。再增加NaOH濃度，黑色素的提取率開(kāi)始降低，可能是因?yàn)闅溲趸c濃度越大，堿溶性雜質(zhì)溶解量會(huì)增加，影響了大鯢皮黑色素在酸沉過(guò)程的析出，導(dǎo)致其提取率降低。因此，單因素確定氫氧化鈉的最適濃度為1.5 mol/L。

圖1 NaOH濃度對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on melanin extraction rate of giant salamander skin

圖2 料液比對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid on melanin extraction rate of giant salamander skin

2.1.2 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響見(jiàn)圖2。由圖 2 可知，隨著料液比的增加，大鯢皮膚黑色素的提取率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著料液比的增加，內(nèi)外濃度差增大，傳質(zhì)動(dòng)力加大，提取率也隨之增大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15時(shí)，提取率最大為0.97%。再增加料液比，其它堿溶性雜質(zhì)的溶解度增加，提取率降低。因此，單因素確定最適料液比為1∶15。

2.1.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

提取溫度對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著溫度升高，提取率先升高后降低，溫度為45 ℃時(shí)提取率最高為0.95%，繼續(xù)升溫至55 ℃，提取率降至0.29%。這可能是溫度升高可增大分子擴(kuò)散系數(shù)，有利于提取率的提高。溫度持續(xù)升高，堿溶性雜質(zhì)溶解度增加，黑色素結(jié)構(gòu)可能破壞，提取率降低。因此，單因素確定最適溫度為45 ℃。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取氫氧化鈉濃度、液料比、提取溫度進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。由表2中R值大小可以看出，各因素影響大小為C(溫度)>A(氫氧化鈉濃度)>B(料液比)，理論上以A2B2C1為最優(yōu)組合。對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行了表3的方差分析，發(fā)現(xiàn)A、B、C因素對(duì)提取工藝均無(wú)顯著性影響(P>0.05)。綜合成本及能耗因素，最終確定大鯢皮膚黑色素提取的最佳工藝為A2B2C1，即在氫氧化鈉濃度為1.5 mol/L，反應(yīng)溫度45 ℃，料液比1∶15 g/mL條件下提取，提取率為0.65%。

圖3 提取溫度對(duì)大鯢皮膚黑色素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on melanin extraction rate of giant salamander skin

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 大鯢皮色素定性分析結(jié)果

2.3.1 UV-VIS光譜譜圖

大鯢皮色素的紅外光譜圖如圖4所示，黑色素多聚物因其高度的共軛效應(yīng)而產(chǎn)生廣譜的光吸收特性。大鯢皮黑色素在紫外區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)為214 nm，在可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有特征吸收峰，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收值隨波長(zhǎng)的增大而減少。這與報(bào)道的不同來(lái)源動(dòng)物黑色素的最大吸收波長(zhǎng)在210 nm左右一致。宋茹等[14]用酶解法制備的魷魚(yú)黑色素在220 nm有特征吸收峰。衡惠等[15]用堿溶酸沉法提取的黑螞蟻黑色素的最大吸收峰在212 nm處。

表3 方差分析

注：F0.05(1,2)=19。

Note:F0.05(1,2)=19.

圖4 大鯢皮色素的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.4 Ultraviolet visible spectrum of giant salamander skin pigment

2.3.2 紅外光譜譜圖

紅外光譜是一種化合物結(jié)構(gòu)鑒定的有效方法，有關(guān)天然和合成黑色素的研究[16]表明，黑色素的紅外光譜大體可歸屬為3 200～3 500 cm-1為吲哚和吡咯結(jié)構(gòu)單元中N-H和O-H的伸縮；2 950～2 980 cm-1為烷基中的C-H的伸縮；1 710 cm-1為羧基中C=O伸縮振動(dòng)；1 610～1 690 cm-1為芳香環(huán)中C=C和C=N的彎曲以及C=O伸縮(酰胺)；1 250～1 468 cm-1為酚羥基和羧羥基；1 100～1 050 cm-1為氨基酸中的醇羥基O-H振動(dòng)；700～600 cm-1為C-S單鍵的伸縮振動(dòng)。

由圖5可知大鯢皮黑色素結(jié)構(gòu)信息如下，N-H 伸縮振動(dòng) (3 296 cm-1)，氨基酸中脂肪族C-H伸縮振動(dòng) (2 858 cm-1、2 931 cm-1)，酰胺C=O伸縮振動(dòng) (1 653 cm-1)，黑色素吲哚環(huán)和氨基酸中N-H的彎曲振動(dòng)(1 543 cm-1)，氨基酸中脂肪族C-C彎曲振動(dòng)(1 455 cm-1)，氨基酸中C-N伸縮振動(dòng)(1 377 cm-1)，酚羥基伸縮振動(dòng)(1 236 cm-1)，C-O伸縮振動(dòng)(1 060 cm-1)，C-S伸縮振動(dòng) (617 cm-1)。1653 cm-1處的強(qiáng)吸收峰推測(cè)其有黑色素典型的苯醌類結(jié)構(gòu)，3 296 cm-1和1 543 cm-1處的吸收峰推測(cè)有吲哚結(jié)構(gòu)，617 cm-1推測(cè)其可能含硫元素。與烏雞黑色素的紅外光譜相比[17]，主要特征吸收峰位置非常接近，說(shuō)明大鯢皮黑色素與烏雞黑色素的主要功能基團(tuán)基本一致。

圖5 大鯢皮色素的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of giant salamander skin pigment

2.3.3 UPLC-MS/MS譜圖

黑色素的基本結(jié)構(gòu)是一些共價(jià)交聯(lián)的吲哚環(huán)，同時(shí)含有不定量的吲哚合成前體物。動(dòng)物黑色素細(xì)胞主要產(chǎn)生真黑色素和脫黑色素。真黑色素是由5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA)黑色素和5,6-二羥基吲哚(DHI)黑色素聚合而成，脫黑色素是由2-S-半胱氨酸和5-S-半胱氨酸聚合脫羧形成的苯丙噻嗪衍生物。由圖6可知，采用1%三乙胺-50%甲醇混合溶液溶解后，三乙胺將大鯢黑色素氧化，通過(guò)色譜柱分離后得到圖3C兩個(gè)色譜峰，保留時(shí)間分別為0.90和2.15 min。采用MS掃描后，可得準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z258和m/z283，結(jié)合真黑色素和脫黑色素的降解過(guò)程及降解產(chǎn)物可知[18]，化合物A相對(duì)分子質(zhì)量為257，名稱為5-(羧(羥)基)-4-(羧羰基)-1H-吡咯-2-羧酸，為真黑色素的降解過(guò)程產(chǎn)物之一；化合物B相對(duì)分子質(zhì)量為282，名稱為6-(2-氨基-2-羧乙基)-2-羧基-4-羥基苯并噻唑 (BTCA)，為脫黑色素的降解產(chǎn)物之一，對(duì)應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)式分別如圖7A、B 所示。初步可知，大鯢皮膚色素由真黑色素和脫黑色素兩種色素組成。

有研究表明烏賊黑色素幾乎為純凈的真黑色素，含有75%的DHICA和20%的DHI[19]，其余5%為結(jié)合蛋白[20]。孫亞真[21]利用高相液相色譜及質(zhì)譜對(duì)烏骨雞黑色素進(jìn)行分析，認(rèn)為烏骨雞黑色素為真黑色素。Borges等[22]對(duì)人體頭發(fā)黑色素的研究表明，頭發(fā)黑色素既有真黑色素，也有脫黑色素。由此可見(jiàn)，不同生物、不同組織中黑色素的組成隨物種的差異而不同。

圖6 大鯢皮色素的UPLC-MS/MS譜圖Fig.6 UPLC-MS/MS spectrum of giant salamander skin pigment注：圖6A為化合物A 質(zhì)譜圖，圖6B為化合物B質(zhì)譜圖，圖6C為大鯢皮色素全掃描總離子流圖。Note:Fig.6A is compound A mass spectrogram,Fig.6B is compound B mass spectrogram,Fig.6C is total ion flow diagram ofgiant salamander.skin pigments.

圖7 大鯢皮色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.7 Chemical structure of giant salamander skin pigment注：圖7A為化合物A名稱【6-(2-氨基-2-羧乙基)-2-羧基-4-羥基苯并噻唑】。圖7B為化合物B名稱【5-(羧(羥)基)-4-(羧羰基)-1H-吡咯-2-羧酸】。Note:Fig.7A is the name of compound A [(6-(2-amino-2-carboxyethyl)-2-carboxylic acid-4-hydroxybenzo[d]thiazole].Fig.7B is the name of compound B [5-(carboxy(hydroxy)methyl)-4-(carboxycarbonyl)-1H-pyrrole-2-carboxylic acid].

2.4 大鯢皮膚色素抗氧化性

2.4.1 超氧自由基清除能力

大鯢皮色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用如圖8所示，從圖8可以看出，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)大鯢皮色素對(duì)超氧自由基均有一定的清除作用，其清除能力與質(zhì)量濃度成正比。當(dāng)濃度在2.5 mg/mL時(shí)，大鯢皮色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為30.51%，而VC對(duì)超氧自由基的清除能力較強(qiáng)，在濃度2 mg/mL時(shí)清除率就已超過(guò)90%。

圖8 大鯢皮膚色素對(duì)超氧陰離子自由基清除率曲線Fig.8 Clearance curves for giant salamander skin pigment to superoxide free radicals

2.4.2 羥基自由基清除能力

大鯢皮色素對(duì)羥基自由基的清除作用如圖9所示：由圖9可知，大鯢皮色素在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)羥自由基的清除作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，但清除作用均低于VC。在濃度為0.5～2.0 mg/mL時(shí)，隨濃度的增加，大鯢皮色素對(duì)羥自由基的清除率顯著升高，但當(dāng)濃度高于2 mg/mL時(shí)，隨濃度的增加，清除率趨于穩(wěn)定。濃度在2.5 mg/mL時(shí)，大鯢皮色素對(duì)羥基自由基的清除率為54.17%，而VC在1.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到93%以上。

圖9 大鯢皮膚色素對(duì)羥基自由基清除率曲線Fig.9 Scavengingcurves for giant salamanderskin pigment to hydroxyl radicals

吳世玉等[23]研究了林蛙卵黑色素的抗氧化性，表明林蛙卵黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，清除超氧陰離子的IC50值為1.250 mg/mL，清除羥自由基的IC50值為0.662 mg/mL。陳士國(guó)等[24]測(cè)定了魷魚(yú)墨黑色素對(duì)羥基自由基與超氧陰離子自由基的清除活性，結(jié)果表明其清除超氧陰離子自由基和羥基自由的IC50值分別為0.015 mg/mL和0.2 mg/mL。動(dòng)物黑色素抗氧化性大小因動(dòng)物種類而存在差異，物種不同，其抗氧化活性也不同。

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶酶解可以去除黑色素中蛋白質(zhì)，堿溶酸沉可以去除黑色素中其他不被酶解的雜質(zhì)，得到高純度的大鯢黑色素。單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定大鯢皮膚黑色素最適提取工藝條為：氫氧化鈉1.5 mol/L、液料比1∶15、提取溫度45 ℃，提取率最高為0.65%。

大鯢皮膚黑色素的紫外最大吸收波長(zhǎng)為214 nm，由真黑色素和脫黑色素兩種色素組成，對(duì)羥自由基和超氧陰離子有一定的清除作用，具抗氧化作用。食用不脫除色素的大鯢系列產(chǎn)品時(shí)，黑色素可進(jìn)入人體，發(fā)揮其抗氧化、延緩衰老功效。此外，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，還可對(duì)大鯢皮黑色素進(jìn)行脫除，將其添加到防曬品、美容護(hù)膚品和藥品中，促進(jìn)大鯢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。