付文鵬，楊永壽，肖培云*

1大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院；2云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理 671000

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。多肽是一類(lèi)具有蛋白質(zhì)特性、分子量比蛋白質(zhì)小、由2～16個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接的化合物[1]。它涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。科研工作者研究發(fā)現(xiàn)，多肽具有抗凝血、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降血壓等作用[1]。蛋白多肽類(lèi)藥物在預(yù)防和治療疾病中具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優(yōu)點(diǎn)[2]，因此具有較大的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前研究比較熱門(mén)的美洲大蠊、地龍、蜈蚣、鹿茸等動(dòng)物類(lèi)中藥的有效成分均以蛋白多肽為主。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊中環(huán)二肽類(lèi)化合物是發(fā)揮創(chuàng)面愈合的重要成分之一[3]，我國(guó)重要的中藥動(dòng)物藥地龍和鹿茸的主要有效成分都是蛋白質(zhì)和多肽[4,5]，蜈蚣毒素有大量分子量在 3～10 KDa的多肽分子[6]。而蛋白多肽的分離純化是其研究與開(kāi)發(fā)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。蛋白多肽屬于大分子物質(zhì)，在分離純化過(guò)程中既要保持其組成成分、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生物活性均不變，還要保證其安全性和高回收率，以達(dá)到經(jīng)濟(jì)環(huán)保的目的。因此，諸多因素限制了傳統(tǒng)的植化分離方法在動(dòng)物源蛋白多肽分離純化中的應(yīng)用，嚴(yán)重阻礙了對(duì)其的研究與開(kāi)發(fā)。本文對(duì)近年來(lái)動(dòng)物源活性蛋白多肽分離純化方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為動(dòng)物藥的研究開(kāi)發(fā)提供思路和參考。

1 沉淀法

1.1 鹽析沉淀

中性鹽對(duì)蛋白多肽的溶解度有顯著影響，一般隨著鹽濃度的升高，蛋白多肽的溶解度也會(huì)增加，當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，其溶解度不同程度下降并先后析出的過(guò)程稱(chēng)為鹽析。分子大小、親水程度不同的蛋白多肽，鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，因此調(diào)節(jié)混合蛋白多肽溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白多肽分段沉淀，再通過(guò)透析除去鹽，達(dá)到分離的目的。

蛋白多肽鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等。因?yàn)榱蛩徜@具有溫度系數(shù)小而溶解度大以及不易引起蛋白質(zhì)變性的優(yōu)點(diǎn)[7]，其在蛋白多肽的鹽析中應(yīng)用最多。冼永權(quán)等[8]在黑螞蟻纖溶活性蛋白的分離純化中，用硫酸銨逐級(jí)鹽析黑螞蟻浸提液，確定其最佳硫酸銨鹽析濃度為30%～90%。周愛(ài)梅等[9]用鹽析-柱層析結(jié)合法分離純化重組人源膠原蛋白，通過(guò)40%飽和度的硫酸銨沉淀與Sephadex G100凝膠柱純化后獲得二聚體，其達(dá)到了電泳純。Mariam等[10]用硫酸銨沉淀法純化兔多克隆免疫球蛋白G(IgG)，用40%飽和度的硫酸銨沉淀時(shí)，回收的多克隆IgG濃度最高(7.8mg/mL)，除白蛋白效果最好(除去72%的白蛋白)。

1.2 等電點(diǎn)沉淀

等電點(diǎn)沉淀是利用蛋白多肽在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，而各種蛋白多肽的等電點(diǎn)有差別，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白多肽的等電點(diǎn)使之沉淀的方法。梁姍姍等[11]采用等電點(diǎn)絮凝法對(duì)蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)進(jìn)行分離回收，不僅分離的蛋白質(zhì)純度高，還有明顯的脫脂及脫色效果。Geng等[12]用聚乙二醇(PEG)沉淀法將雞蛋清中的卵清蛋白(OVA)與卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵類(lèi)粘蛋白分離，富含OVA的上清液再用等電點(diǎn)沉淀(pI為4.5和溫度為4 ℃)進(jìn)一步純化，HPLC檢測(cè)OVA的純度為95.1%，產(chǎn)率為46.4%。

1.3 低溫有機(jī)溶劑沉淀

低溫有機(jī)溶劑沉淀是通過(guò)加入與水可混溶的甲醇、乙醇或丙酮等中性有機(jī)溶劑，降低電解質(zhì)的介電常數(shù)和破壞了蛋白多肽的膠體性，使多數(shù)蛋白多肽的溶解度降低并析出的方法。用不同濃度的有機(jī)溶劑并結(jié)合調(diào)節(jié)pH和離子強(qiáng)度可以分段沉淀不同的蛋白質(zhì)[13]。馬建[14]采用有機(jī)溶劑沉淀法對(duì)還原型谷胱甘肽抽提液進(jìn)行了初步分離提純，確定了最佳工藝為：有機(jī)溶劑選用乙醇，乙醇與樣品的體積比為5，pH的適宜范圍為3.0～3.4，溫度為5 ℃。

2 色譜法

2.1 反相高效液相色譜

反相色譜(Reversed phase chromatography， RPC)是用極性大于固定相的有機(jī)溶劑(如甲醇、異丙醇、乙腈等)水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行物質(zhì)分離和分析的一種色譜方法。用于分離蛋白多肽的反相色譜固定相使用最廣是C8或C4配基的填料；應(yīng)用最廣的流動(dòng)相是水-甲醇、水-乙腈和水-異丙醇。為使樣品組分有較好的溶解性，通常流動(dòng)相pH在2～4之間，并且低pH抑制了樣品組分中酸性基團(tuán)及硅膠上硅羥基的解離及非特異性吸附作用[15]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，向流動(dòng)相中添加10%～16%三氟乙醇(TFE)能顯著改善肽的色譜分離[16]。Ghassem等[17]應(yīng)用反相高效液相色譜將鯉魚(yú)肌原纖維蛋白具有ACE抑制活性最高的組分F2分成五個(gè)組分(A～E)，并結(jié)合ESI-TOF MS / MS進(jìn)行氨基酸序列分析，得知這些肽具有高ACE抑制活性的原因是在C-末端序列處存在兩個(gè)脯氨酸殘基。Basseri等[18]用高效液相色譜從美洲大蠊免疫誘導(dǎo)的血淋巴中分離到分子量62 KDa的抗菌肽。Ennaas等[19]用反相高效液相色譜從大鯖魚(yú)的副產(chǎn)物protamex水解產(chǎn)物中分離得到四種抗菌肽。

2.2 凝膠排阻色譜

凝膠排阻色譜(gel exclusion chromatography)又叫凝膠色譜、分子篩色譜、凝膠過(guò)濾等，其分離機(jī)理是根據(jù)溶質(zhì)分子大小進(jìn)行過(guò)篩，溶液中所有組分按分子尺寸由大到小的順序流出 ，達(dá)到分離的目的。它既適用于分子量較低的多肽、聚核苷酸等生物分子的分離，也適用于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的純化。凝膠色譜主要有Sephadex G系列、Superose系列、硅膠系列、Bio-Gel Px系列等。Wang等[20]將鯊魚(yú)皮水解產(chǎn)物通過(guò)SP-Sephadex C-25柱，Sephadex G-50柱和C18反相高效液相色譜分離，得到一個(gè)分子量為906Da的親水性三肽，氨基酸序列是GAIGPAGPLGP。宋雪梅[21]通過(guò)Sephadex G-25凝膠色譜對(duì)牛乳硬質(zhì)干酪中的苦味肽進(jìn)行分離，得到3個(gè)組分，經(jīng)鑒定組分Ⅱ中存在14種苦味肽。Jiang等[22]通過(guò)Sephadex G-50凝膠色譜，用75%乙醇洗脫，從乳清蛋白的胰蛋白酶水解物中分離出分子量范圍為1.9 KDa～3.1 KDa降膽固醇肽。

2.3 離子交換色譜

離子交換色譜(ion exchange chromatography，IEC)是利用離子交換樹(shù)脂對(duì)各種離子的親和力不同，從而使能離子化的化合物得到分離的方法。目前在蛋白質(zhì)或多肽的分離純化中，離子交換色譜是應(yīng)用最廣泛的方法之一，占75%[15]。離子交換色譜主要分為陽(yáng)離子交換柱和陰離子交換柱兩大類(lèi)型，根據(jù)蛋白或多肽所帶電荷的差異并盡量保持其活性選擇柱型。影響離子交換的因素有pH值、溫度、洗脫劑、離子強(qiáng)度等。在離子交換色譜純化多肽的試驗(yàn)中，柱填料的選擇對(duì)于分離效果影響很大，查恩輝[23]比較了不同柱填料對(duì)梅花鹿茸多肽的分離效果，其中CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱與Q-Sepharose Fast Flow離子交換柱，分離速度較快，柱料再生較為簡(jiǎn)単，只需用3個(gè)柱床體積的高濃度鹽溶液沖洗即可。Geng等[24]用聚乙二醇沉淀雞蛋清，將其分成四個(gè)組分(A～D)，除卵霉素(沉淀物A)外，其他三個(gè)組分都通過(guò)Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進(jìn)一步純化。分別從沉淀物B、沉淀物C和上清液D中純化得到溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃蛋白，HPLC測(cè)定純度分別為91.84%、94.55%、96.45%和88.16%。Wang等[25]通過(guò)DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱純化兔和豚鼠血清中的免疫球蛋白G，用Tris-HCl緩沖液作為洗脫劑，考察了pH7.0和pH8.5的Tris-HCl緩沖液對(duì)免疫球蛋白G回收率和純度的影響，發(fā)現(xiàn)pH8.5的Tris-HCl緩沖液較好。

2.4 親和色譜

親和色譜(affinity chromatography)是利用生物分子間專(zhuān)一的親和力進(jìn)行分離的一種色譜技術(shù)。蛋白多肽等生物大分子能和某些相對(duì)應(yīng)的分子專(zhuān)一而可逆地結(jié)合，可以用于對(duì)生物分子的分離純化。由于親和力具有高度的專(zhuān)一性，使得親和色譜分辨率很高，是分離生物大分子的一種理想色譜方法。按照特異親和作用分為抗原-抗體、酶-底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈等[26]，對(duì)多肽類(lèi)物質(zhì)分離目前主要應(yīng)用其單抗或生物模擬配基與其親和。Xin等[27]用親和色譜分離牛肺抑肽酶，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析和凝膠過(guò)濾層析表明該蛋白為單一多肽，純度分別約為97%和100%。Lan等[28]利用磁性親和分離法快速純化和表征蜥蜴魚(yú)蛋白水解物中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽，并通過(guò)反相高效液相色譜進(jìn)一步純化，得到活性最高的ACE抑制肽，其氨基酸序列為Gly-Met-Lys-Cys-Ala-Phe。

3 膜分離

膜分離技術(shù)(membrane separation technique)是借助一定孔徑的高分子薄膜，通過(guò)在膜兩側(cè)施加一個(gè)推動(dòng)力，將不同大小、性狀和特性的物質(zhì)分離的技術(shù)。根據(jù)驅(qū)動(dòng)方式和分離原理，膜分離可分為微濾、超濾、反滲透、電滲析等。微濾能截留直徑0.2～2 μm的顆粒，可除去淀粉、細(xì)菌、霉菌、乳化油等雜質(zhì)；超濾截留直徑0.02～0.22 μm的顆粒，相當(dāng)于分子量1000～5×105Da，可濾出蛋白質(zhì)、脂肪、色素等物質(zhì)；反滲透膜孔徑小至納米級(jí)，在一定壓力下，水分子可以通過(guò)反滲透膜，而水中的無(wú)機(jī)鹽、重金屬離子、有機(jī)物、膠體、細(xì)菌、病毒等無(wú)法通過(guò)反滲透膜；電滲析主要用于水溶液中除去電解質(zhì)、電解質(zhì)與非電解質(zhì)的分離和膜電解等[7]。

李水清等[29]在鱉甲多肽的膜分離工藝的研究中，先采用0.3 μm微濾膜預(yù)處理鱉甲多肽提取液，再依次通過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量20 KDa和8 KDa的超濾膜，經(jīng)過(guò)多級(jí)超濾，鱉甲多肽的分離效果較為理想。Lin等[30]采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為5 KDa和1 KDa的超濾膜對(duì)蛤蜊肌肉水解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到兩種氨基酸序列為Val-Lys-Pro和Val-Lys-Lys的降膽固醇肽。Zhang等[31]用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 KDa,5 KDa和3 KDa的超濾膜對(duì)大黃魚(yú)蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)處理，獲得抗氧化活性最高的組分后再用其他分離手段進(jìn)一步純化，得到兩種抗氧化肽，其氨基酸序列為Ser-Arg-Cys-His-Val和Pro-Glu-His-Trp。

4 電泳法

電泳(phoresis)是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。1809年俄國(guó)的物理學(xué)家Pence首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，直到1937年瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電泳儀，才作為一種分析方法不斷發(fā)展和應(yīng)用。根據(jù)電泳的分離特點(diǎn)，電泳法分為自由界面電泳、區(qū)帶電泳、高效毛細(xì)管電泳。其中，區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。在蛋白多肽的分析研究中，應(yīng)用最廣泛的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)就是屬于區(qū)帶電泳。用SDS-PAGE既能測(cè)定蛋白多肽的分子質(zhì)量，又可以用于蛋白多肽混合組分的分離和亞組分的分析。

目前，電泳法主要應(yīng)用在測(cè)定蛋白多肽的分子質(zhì)量。蘇翔等[32]用SDS-PAGE對(duì)螞蟻抗菌肽進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，SDS-PAGE電泳結(jié)果為單一條帶，其分子質(zhì)量為3.746 KDa。Cheema等[33]用瓊脂糖凝膠親和層析從雜交公牛的精漿中純化得到肝素結(jié)合蛋白，通過(guò)SDS-PAGE分析鑒定出14個(gè)條帶，分子量范圍為14～150 KDa。但是SDS-PAGE對(duì)于小分子量尤其是10 KDa以下的蛋白質(zhì)分辨率較低，在分離膠中添加甘油或尿素的Tricine-SDS-PAGE能檢測(cè)小分子多肽的分子量，該方法能夠消除由于多肽分子與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的不同帶來(lái)的誤差[34]。高世杰等[35]用SDS-PAGE對(duì)全蝎蛋白進(jìn)行分離，所得的結(jié)果不理想，僅可獲得7條譜帶，且條帶分辨率低。采用Tricine-SDS-PAGE，利用三層不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，可以得到11條分辨率較高的電泳譜帶，而利用兩層不連續(xù)系統(tǒng)時(shí)則分離效果稍差，只能得到9條較清晰譜帶，因此對(duì)于小分子量蛋白的分離應(yīng)盡量使用三層膠系統(tǒng)。SDS-PAGE測(cè)定許多高分子量蛋白質(zhì)(MW﹥100 KDa)時(shí)分辨率差，故測(cè)定高分子量蛋白質(zhì)應(yīng)采用能提高分辨率的脈沖SDS-PAGE電泳[36]。

表1 動(dòng)物源活性蛋白多肽分離純化方法總結(jié)

5 多方法聯(lián)用

由表1可看出不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)和所適用的范圍，對(duì)于動(dòng)物蛋白多肽的分離純化，要根據(jù)樣品的性質(zhì)來(lái)選擇合適的方法，而且只用一種方法是很難實(shí)現(xiàn)的，大多數(shù)都要采用兩種或兩種以上方法聯(lián)用。王心龍等[3]采用MCI gel CHP 20P柱、Sephadex LH-20凝膠柱、制備型HPLC和半制備型HPLC等色譜手段，從美洲大蠊中分離出14個(gè)環(huán)二肽類(lèi)化合物。Nimalaratne等[39]采用超濾、陽(yáng)離子交換色譜和反相高效液相色譜從蛋清水解產(chǎn)物中分離純化到16種抗氧化肽，并用LC-MS/MS測(cè)定其氨基酸序列。胡春玲等[40]通過(guò)超濾、葡聚糖凝膠Sephadex G-15及高效液相色譜法對(duì)鱉甲水解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到一個(gè)純化的寡肽(CTEPH-1:Asn-Pro-Asn-Pro-Thr)。Matsumoto等[41]對(duì)牡蠣消化性水解產(chǎn)物A-3中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的分離純化時(shí)，先用SP-Sephadex C-25和Toyopearl HW-40凝膠色譜分離，然后再通過(guò)三步高效液相色譜法，分離出血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。Huang等[42]通過(guò)DEAE陰離子交換色譜，Sephadex G-25凝膠過(guò)濾和反相高效液相色譜從乳清蛋白水解物中分離鈣結(jié)合肽，在色譜/電噴霧電離(LC/ESI)串聯(lián)質(zhì)譜上鑒定出該純化肽的分子量為20 402 Da。

6 總結(jié)與展望

動(dòng)物源蛋白多肽類(lèi)物質(zhì)，分子量較大，極性較強(qiáng)且容易變解，采用傳統(tǒng)的植化分離方法很難得到目標(biāo)物質(zhì)，故需結(jié)合物質(zhì)組分的特殊性質(zhì)來(lái)選擇合適的分離手段。對(duì)于動(dòng)物蛋白多肽的分離純化，目前為止沒(méi)有一種萬(wàn)能的方法，只能根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)和具體的實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇適合的分離方法。沉淀分級(jí)和膜分離主要用于動(dòng)物蛋白多肽的初級(jí)分離，但是蛋白多肽沉淀分級(jí)的條件較難控制；而膜分離技術(shù)在分離過(guò)程中無(wú)相變或化學(xué)變化，并且具有高選擇性、低能耗、適應(yīng)性強(qiáng)、操作條件要求不高、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)性質(zhì)相似組分可以達(dá)到很好的分離效果[43,44]。色譜法是蛋白多肽分離純化中的高效分離方法，也是目前動(dòng)物蛋白多肽分離純化的主要技術(shù)手段，但是不同動(dòng)物蛋白多肽分離時(shí)所需的條件又各不相同，尋找分離條件耗時(shí)長(zhǎng)，導(dǎo)致效率低；高效液相色譜法具有分離度高、分離能力強(qiáng)及分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此在分離動(dòng)物蛋白多肽時(shí)得到廣泛應(yīng)用。電泳主要作為一種分析方法用于測(cè)定蛋白多肽的分子質(zhì)量，而作為制備電泳來(lái)分離蛋白多肽混合組分還應(yīng)用較少。因此，對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物源活性蛋白多肽的分離純化，高效、經(jīng)濟(jì)、適應(yīng)性強(qiáng)的多方法聯(lián)用將會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展的重視，動(dòng)物源活性蛋白多肽的醫(yī)療保健價(jià)值將會(huì)不斷被發(fā)掘。對(duì)于動(dòng)物源活性蛋白多肽的分離純化方法也會(huì)趨向于更加安全、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方向發(fā)展。