王立哲，王振賢，馬曉偉

（1．邯鄲市中心醫(yī)院東區(qū)康復(fù)醫(yī)學(xué)科，邯鄲 056001；2．邯鄲市中心醫(yī)院內(nèi)分泌一科，邯鄲 056001；3．邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，邯鄲 056001）

長期高血糖將誘發(fā)多組織器官并發(fā)癥，包括睪丸組織，其發(fā)病率較非糖尿病患者高10倍以上，嚴重影響患者生命健康和質(zhì)量[1]。藏紅花素（Crocin）是在番紅花中發(fā)現(xiàn)的一種水溶性化合物，具有良好的抗氧化作用和抗炎作用[2-3]，既往研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有改善糖尿病大鼠胸主動脈環(huán)舒縮功能、抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮損傷的作用[4-5]，并且王素蓮等[6]研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有降低血脂的藥理學(xué)作用。本實驗采用鏈脲佐菌素（STZ）連續(xù)3 d腹腔注射30 mg/（kg·d）的方法制備實驗性2型糖尿病大鼠模型，研究藏紅花素對2型糖尿病大鼠睪丸組織并發(fā)癥的抑制作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠100只（7周齡、體質(zhì)量210～250 g），購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫恒濕（23～25℃、相對濕度 65%～70%），光照周期12 h：12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥物、試劑 藏紅花素（美國Sigma公司，純度≥99．9%，批號：E170411b）；睪酮試劑盒、糖化血紅蛋白（GHb）測試盒（南京建成生物工程研究所）；胰島素測定試劑盒（美國密理博公司）；TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、模型制備與給藥 100只SD大鼠按照體質(zhì)量隨機分為正常對照組，模型對照組，藏紅花素25 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）組，各組均20只。采用STZ連續(xù)3 d腹腔注射30 mg/（kg·d）的方法制備實驗性2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖水平持續(xù)高于16．7 mmol/L認定為造模成功。稱取適量藏紅花素，生理鹽水溶解并分別配置濃度為50、25、12．5 mg/mL 的藏紅花素溶液，1 次/日，正常對照組和模型組均同步給予等劑量的0．9%氯化鈉溶液（2 mL/kg），療程12周。

1.3.2 空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、糖化血紅蛋白（GHb）的測定 治療完成后，通過尾靜脈空腹采血，通過血糖儀測定FBG，并按試劑盒測定FINS水平和GHb水平。

1.3.3 稱量體質(zhì)量并計算睪丸指數(shù) 治療完成后分別稱取體質(zhì)量并記錄；腹腔注射水合氯醛實施麻醉，取睪丸組織并沖洗干凈后，稱量右側(cè)睪丸質(zhì)量，睪丸指數(shù)（%）=（睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。

1.3.4 睪酮含量測定 各組大鼠取睪丸組織前，開腹并經(jīng)腹主動脈取血，1 500 r/min離心10 min取血清，通過生化分析儀測定各組大鼠血清中睪酮含量。

1.3.5 睪丸組織病變及細胞凋亡的觀察 取稱質(zhì)量后的右側(cè)睪丸組織，置10%甲醛溶液中進行固定，然后依次行石蠟包埋、切片、展片，然后通過常規(guī)HE染色進行睪丸組織病理學(xué)檢查；取石蠟切片，根據(jù)試劑盒說明進行TUNEL染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡下觀察胰島細胞凋亡（細胞核黃染為陽性著色）；計算凋亡指數(shù)（AI）：AI=（凋亡細胞數(shù)/胰島總細胞數(shù)）×100%，每張切片分別取5個視野，分別進行計數(shù)和計算，然后取平均值。

1.3.6 透射電鏡觀察睪丸組織超微細胞結(jié)構(gòu) 取左側(cè)睪丸組織、快速修剪成約1 mm3小塊，置于預(yù)冷（4℃）戊二醛溶液（濃度 2．5%）中固定 1 h后，進行磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗、丙酮梯度脫水進行逐步處理，然后依次進行Epon812包埋、超薄切片和鉛鈾雙重染色，通過H-7650型透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用軟件SPSS19．0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBG、FINS及GHb 水平測定結(jié)果 糖尿病模型對照組大鼠FBG水平、GHb水平較正常對照組大鼠均顯著升高（P＜0．01），F(xiàn)INS 水平顯著降低（P＜0．01）。與模型對照組比較經(jīng)藏紅花素50～100mg（/kg·d）治療12周能夠顯著降低糖尿病大鼠FBG水平并提高FINS水平（P＜0．01或P＜0．05），并且藏紅花素100mg（/kg·d）組 GHb 水平顯著降低（P＜0．05）。見表 1。

2.2 體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及睪酮含量測定結(jié)果 糖尿病模型對照組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)和血清睪酮含量顯著降低（P＜0．01）；經(jīng)藏紅花素50～100 mg（/kg·d）治療12周能夠顯著提高糖尿病大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)和血清睪酮含量，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01 或 P＜0．05）。見表 2。

表1 各組大鼠FBG、FINS及GHb水平（s）Tab.1 Levelsof FBG，F(xiàn)INSand GHb of the rats in each group（±s）

表1 各組大鼠FBG、FINS及GHb水平（s）Tab.1 Levelsof FBG，F(xiàn)INSand GHb of the rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與模型對照組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

GHb（μg/mL）正常對照組 20 6．09±0．91 13．17±1．98 33．16±1．54模型對照組 20 17．24±2．60* 7．42±1．36*45．82±4．63*藏紅花素25mg/（kg·d）組20 15．93±2．87 8．56±1．48 44．75±4．79藏紅花素50mg/（kg·d）組20 11．75±2．68#9．23±1．70#38．06±4．25藏紅花素100 mg/（kg·d）組20 9．52±2．61##10．54±1．49##36．72±3．68#組別 動物數(shù) FBG（mmol/L）FINS（mU/mL）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量（±s）Tab.2 Body weight，testistissue index and the contentsof serum testosterone content of the ratsin each group（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量（±s）Tab.2 Body weight，testistissue index and the contentsof serum testosterone content of the ratsin each group（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與模型對照組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

睪酮（nmol/L）正常對照組 20 370．95±24．73 0．45±0．08 22．79±1．63模型對照組 20 168．14±17．68*0．28±0．07*16．16±1．58*藏紅花素25 mg/（kg·d）組20 184．26±19．03 0．30±0．08 17．28±2．09藏紅花素50 mg/（kg·d）組20 215．11±21．64#0．38±0．10##20．01±1．84#藏紅花素100 mg/（kg·d）組20 238．49±22．75##0．42±0．12##21．67±1．99##組別 動物數(shù) 體質(zhì)量（g） 睪丸指數(shù)（%）

2.3 睪丸組織病理學(xué)檢查結(jié)果 與正常對照組比較，糖尿病模型對照組大鼠睪丸組織呈現(xiàn)明顯的病理異常，主要表現(xiàn)為曲細精管萎縮、生精細胞脫落、生精細胞數(shù)量減少、精子數(shù)量嚴重減少等；與模型對照組比較經(jīng)藏紅花素治療12周能夠不同程度改善糖尿病大鼠睪丸組織病變，組間比較，以藏紅花素100 mg/（kg·d）組效果最為顯著，見圖1。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×400）Fig.1 Testicular histopathological examination resultsof rats in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠睪丸組織細胞超微結(jié)構(gòu) 正常對照組：胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)分布均勻，細胞器豐富；模型對照組：胞核固縮、染色質(zhì)呈塊狀聚集、細胞器數(shù)量減少；藏紅花素25 mg/（kg·d）組：染色質(zhì)塊狀邊集現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，細胞器略增多，間質(zhì)血管內(nèi)壁較光滑；藏紅花素50 mg/（kg·d）組：胞核呈類圓形，染色質(zhì)分別較均勻，細胞器數(shù)量明顯增多；藏紅花素100 mg/（kg·d）組：胞核呈橢圓形或梭型，染色質(zhì)分布均勻且無邊集現(xiàn)象，細胞器顯著增多。見圖2。

圖2 各組大鼠睪丸組織細胞超微結(jié)構(gòu)（透射電鏡，×3 000）Fig.2 The ultrastructure of testicular tissue cells in each group（transmission electron microscope，×3 000）

2.5 細胞凋亡狀況觀察結(jié)果 與正常對照組比較，糖尿病模型對照組大鼠睪丸組織凋亡細胞數(shù)量明顯增多；經(jīng)藏紅花素治療12周能夠不同程度減少糖尿病大鼠睪丸組織凋亡細胞數(shù)量。計算各組大鼠睪丸組織細胞 AI：正常對照組 AI為（2．61±0．79）%，模型對照組AI為（46．13±6．08）%，藏紅花素25mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）組AI分別為（39．35±6．37）%、（28．97±5．16）%、（25．00±4．72）%；模型對照組 AI較正常對照組顯著升高（P＜0．01），而與模型對照組比較，經(jīng)藏紅花素50～100 mg/（kg·d）治療12周能夠顯著降低糖尿病大鼠睪丸組織細胞AI（P＜0．01或 P＜0．05）。見圖 3。

3 討論

睪丸組織并發(fā)癥是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，尤其是長期血糖控制不佳的多年糖尿病患者，嚴重影響患者生活質(zhì)量。因此，糖尿病患者應(yīng)注意睪丸組織并發(fā)癥的發(fā)生與防治。既往研究發(fā)現(xiàn)高血糖引發(fā)的睪丸組織結(jié)構(gòu)、細胞病變以及繼發(fā)性細胞凋亡是糖尿病所致睪丸組織并發(fā)癥的重要病理機制[7-9]。

本實驗參照李徽徽等[10]和闞敏宸[11]的研究方法，采用連續(xù)腹腔注射STZ的方法制備實驗性2型糖尿病大鼠模型，研究藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織損傷的保護作用。藏紅花素是從番紅花中提取的一種具有多種生物學(xué)活性的單體化合物，既往研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有改善糖尿病大鼠胸主動脈環(huán)舒縮功能、抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮損傷、降低血脂的藥理學(xué)[4-6]。但藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織損傷是否具有保護作用尚未見文獻報道。本研究通過制備2型糖尿病大鼠模型并給予藏紅花素進行治療，研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素能夠改善糖尿病大鼠睪丸組織曲細精管萎縮、生精細胞脫落、生精細胞數(shù)量減少、精子數(shù)量嚴重減少等病變，改善睪丸組織細胞細胞體積縮小、細胞核固縮、染色質(zhì)塊狀濃集、線粒體等細胞器減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等超微結(jié)構(gòu)病變，抑制睪丸組織細胞凋亡，本研究結(jié)果與毛孫忠等[12]的研究報道基本一致。提示藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織并發(fā)癥損傷具有一定的保護作用。

圖3 各組大鼠睪丸組織細胞凋亡狀況（TUNEL，×400）Fig.3 Theapoptosisof testicular tissueof theratsin each group（TUNEL，×400）

睪酮又稱睪丸素，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，是機體重要的雄性激素，對精子生成具有重要的促進作用。血糖持續(xù)偏高是導(dǎo)致睪丸萎縮、睪丸功能降低的重要病理機制，睪丸指數(shù)也是反映睪丸狀態(tài)的重量指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示：經(jīng)藏紅花素治療12周能夠有效提高糖尿病大鼠睪丸指數(shù)和睪酮水平，提示藏紅花素具有改善糖尿病大鼠睪丸功能的作用。

綜上所述，藏紅花素能夠有效抑制糖尿病大鼠睪丸組織損傷，其機制可能與其提高胰島素水平、降低血糖作用有關(guān)。