崔勇和，沈先敏

（襄陽市中心醫(yī)院藥學部，湖北文理學院附屬醫(yī)院，襄陽 441021）

隨著醫(yī)療技術不斷的革新，介入、多層螺旋CT及三維重建技術的普及，對比劑在診斷治療中的應用越發(fā)受到重視。然而，對比劑致急性腎損傷（CIAKI）在臨床上出現(xiàn)的風險也越來越高，為導致院內腎功能衰竭的三大原因之一，僅次于腎臟灌注不足及腎毒性藥物，而CIAKI占據(jù)院內獲得性腎功能衰竭的11%[1-2]。引起CIAKI發(fā)生發(fā)展的病因較多，其中對比劑引起腎臟微血管血流動力學改變、對比劑導致腎小管的毒性、氧化損傷、炎性反應及腎小管梗阻等均會誘導CIAKI的發(fā)生[3-4]。其中炎性損傷可能是誘導CIAKI發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）在各種刺激下會引起NLRP3炎性通路的活化，誘導IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的釋放[5-6]；并且研究報道在急性腎損傷模型中TXNIP/NLRP3信號通路處于高度活化的狀態(tài)[7]。白藜蘆醇主要提取于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物，屬于一種天然的抗炎劑[8]，并且其具有明顯的降低蛋白尿及保護腎的藥理活性[9]。因此，本研究從細胞水平研究白藜蘆醇對人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）在脂多糖（LPS）誘導炎性損傷中的作用，并觀察其對TXNIP/NLRP3信號通路的影響。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 白藜蘆醇（湖北盛天恒創(chuàng)生物有限公司，批號：13065-54-8，純度≥99%）；人腎小管上皮（HK-2）細胞由上海斯信科技生物有限公司提供（來源于美國ATCC細胞庫）；1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermoscientific公司（批號：R001100）；CCK8試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司（批號：CK04）；LPS（批號 L2880，美國 Sigma公司）；IL-6、IL-1β 及TNF-αELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司（批號分別為：WK15204，WK25540，WK36640）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自武漢谷歌生物有限公司（批號：P57460）；兔抗鼠 β-actin（貨號 ab108267）、iNOS（貨號 ab152104）、COX-2（貨號 ab105217）、TXNIP（貨號 ab1520107）及 NLRP3（貨號 ab1663570）一抗均購自英國Abcam公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 BIORAD-550型酶標儀（美國伯樂公司）；BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）；

SPX-250型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1.3 HK-2細胞培養(yǎng) 采用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2濃度，待細胞長滿至95%左右時用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個培養(yǎng)瓶進行傳代培養(yǎng)。

1.4 白藜蘆醇對HK-2細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞消化、離心、重懸后，以5×104個/mL的細胞濃度接種于96孔板，每孔加入200μL的細胞懸液，每組設置5個復孔。細胞培養(yǎng)過夜后用于后續(xù)實驗，實驗分為5組：正常對照組、LPS誘導組、LPS+低劑量（50μmol/L）白藜蘆醇組、LPS+中劑量（100μmol/L）白藜蘆醇組、LPS+高劑量（200μmol/L）白藜蘆醇組，首先在藥物組中加入相應濃度白藜蘆醇溶液，2 h后再加入LPS溶液。培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入10μL CCK8試劑，孵育1 h后采用酶標儀450 nm波長下OD值。實驗重復3次，計算細胞相對存活率。

1.5 藜蘆醇對HK-2細胞炎性因子水平的影響將對數(shù)生長期細胞進行消化重懸接種于6孔板，待細胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，按“1．4”項分組及藥物處理24 h后收集細胞及細胞上清，細胞上清用于炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平檢測，其操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6 藜蘆醇對HK-2細胞炎性蛋白及TXNIP/NLRP3信號通路的影響 將“1．5”項收集的細胞裂解制備成勻漿，離心收集上清提取細胞蛋白，BCA法測定細胞總蛋白濃度。各孔取50μg的蛋白上樣，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，將分離后的蛋白電轉移至NC膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h后，分別加入iNOS、COX-2、TXNIP及NLRP3抗體（體積稀釋比例均為1：1 000）4℃反應過夜。次日以TBST洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1：3 000），室溫反應1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20．0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05 具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對HK-2細胞相對存活率的影響 各組間HK-2細胞相對存活率比較見圖1，提示LPS誘導組HK-2細胞相對存活率顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與 LPS 誘導組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細胞相對存活率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能促使HK-2細胞增殖。

圖1 各組間HK-2細胞相對存活率的比較Fig.1 Comparison of the relative survival rate of HK-2 cellsin each group

2.2 白藜蘆醇對HK-2細胞上清炎性因子含量的影響 各組間HK-2細胞上清炎性指標水平比較見表1所示，提示LPS誘導組HK-2細胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與 LPS 誘導組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能抑制細胞炎性因子的釋放。

表1 各組間HK-2細胞上清炎性因子水平比較（±s）Tab.1 Comparison of the inflammatory cytokines levelsof HK-2 cellsin each group（±s）pg/mL

表1 各組間HK-2細胞上清炎性因子水平比較（±s）Tab.1 Comparison of the inflammatory cytokines levelsof HK-2 cellsin each group（±s）pg/mL

注：與正常對照組比較，*P＜0．05；與 LPS 誘導組比較，#P＜0．05。

組別 IL-6 IL-1β TNF-α正常對照組 592．5± 85．4 58．1± 9．6 76．5± 9．6 LPS 誘導組 1 740．8±256．3*152．7±16．4*184．6±14．8*LPS+低劑量白藜蘆醇組 1 306．4±210．7#119．5±20．7#149．3±16．3#LPS+中劑量白藜蘆醇組 995．7±224．1# 86．3±15．2#116．7±11．7#LPS+高劑量白藜蘆醇組 706．2±168．5# 67．4±12．6# 84．2± 8．2#

2.3 白藜蘆醇對HK-2細胞炎癥蛋白iNOS及COX-2表達的影響 各組間HK-2細胞炎癥蛋白iNOS及COX-2表達水平比較見圖2所示，提示LPS誘導組HK-2細胞iNOS及COX-2表達水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與LPS誘導組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細胞iNOS及COX-2表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能抑制細胞炎性蛋白iNOS及COX-2的表達。

圖2 不同組間炎性蛋白表達比較Fig.2 Comparison of inflammatory proteinsexpression in deferent groups

2.4 白藜蘆醇對HK-2細胞中TXNIP/NLRP3信號通路的影響 各組間HK-2細胞TXNIP、NLRP3蛋白表達水平比較見圖3所示，提示LPS誘導組HK-2細胞TXNIP、NLRP3蛋白表達水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與 LPS 誘導組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細胞TXNIP、NLRP3蛋白表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能抑制HK-2細胞TXNIP/NLRP3信號通路的活化。

3 討論

CIAKI會進一步引起腎間質纖維化，后者為多種腎臟疾病導致的腎臟功能進行性惡化的重要過程，為各種腎臟病變發(fā)展到終末期腎衰竭的共同環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)在腎間質細胞的炎性損傷、間質成纖維細胞增殖及胞外基質過度沉積等[10]。腎小管上皮細胞在細胞因子的刺激下，能夠轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，參與腎間質纖維化。由于腎小管上皮細胞的存在，其轉分化過程的進展程度對于腎臟病的預后至關重要。于是，探索有效抑制腎小管上皮細胞轉分化的藥物對于改善腎臟疾病有著重要作用。

圖3 不同組間TXNIP及NLRP3蛋白表達比較Fig.3 Comparison of TXNIPand NLRP3 proteins expression in different groups

白藜蘆醇屬于一種天然的多酚醇類化合物，主要存在于葡萄籽、花生、虎杖等多種植物中，它對心血管、腫瘤、風濕性關節(jié)炎等多種疾病都有保護作用。白藜蘆醇可以通過抑制氧化應激損傷及炎性損傷保護糖尿病大鼠的腎臟功能，其作用機制與激活Nrf2/Keap1信號通路有關[11]；細胞學實驗提示白藜蘆醇可通過活化Nrf2/ARE信號通路抑制腎臟系膜細胞的增殖[12]；還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過抑制谷胱甘肽轉移酶活性緩解早期大鼠的腎功能損傷[13]。然而白藜蘆醇對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞炎性損傷的保護作用研究甚少，于是本研究觀察了白藜蘆醇對脂多糖誘導的HK-2細胞炎性反應的保護作用及其作用機制。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖能明顯誘導HK-2細胞炎性損傷，表現(xiàn)在細胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著升高，細胞中炎癥蛋白iNOS及COX-2表達的顯著增高以及細胞相對存活率的明顯降低，提示脂多糖構建的HK-2細胞炎性損傷模型是成功的。接著采用不同濃度白藜蘆醇干預HK-2細胞后，發(fā)現(xiàn)其能明顯誘導HK-2細胞增殖，并抑制炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的產生及炎性蛋白iNOS、COX-2的表達，說明白藜蘆醇對脂多糖誘導的HK-2細胞炎性損傷具有顯著的保護作用。

炎性損傷在多種腎病的發(fā)生機制中起著關鍵的誘導作用，多種刺激可使間質細胞及內皮細胞的炎性因子水平增高，使其處于炎性損傷狀態(tài)。然而炎性狀態(tài)下會誘導TXNIP與NLRP3的相互作用引起NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路的活化。并且NLRP3在糖尿病腎病及腎缺血再灌注損傷中起著關鍵性作用，于是降低炎性小體NLRP3的活化能抑制炎性反應，可進一步改善腎臟損傷的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)脂多糖能明顯誘導TXNIP、NLRP3蛋白的表達上調，進一步導致炎性反應；然而白藜蘆醇能明顯抑制TXNIP、NLRP3蛋白的表達，降低了TXNIP/NLRP3炎性信號通路的活化，從而達到抑制炎性反應的藥理作用?？傊?，白藜蘆醇可以明顯抑制LPS誘導的HK-2細胞炎癥損傷，抑制炎癥相關蛋白的表達，其作用機制可能與抑制TXNIP/NLRP3炎性通路活化相關。