武海闊，張榮榮，王 軍，李夢(mèng)虎

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

糖尿病下肢血管病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，是造成患者傷殘與死亡的重要原因。目前認(rèn)為糖尿病大血管病變的病理改變主要為內(nèi)膜、中膜層厚度增加，管腔狹窄，管壁順應(yīng)性降低，內(nèi)膜粥樣斑塊形成致管腔進(jìn)一步狹窄，直至完全閉塞產(chǎn)生臨床癥狀。高血糖與高血脂的毒性作用、蛋白質(zhì)非酶糖基化、內(nèi)皮功能障礙等因素聯(lián)合作用于血管壁，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖，膠原過度表達(dá)，最終形成血管纖維化。本課題組前期證明，糖尿病足患者血管病變是以內(nèi)膜的纖維性增厚為主，脂質(zhì)沉積以纖維成分所占比例大。JNK又被稱為蛋白激酶，近年發(fā)現(xiàn)，JNK信號(hào)通路和纖維化相關(guān)。因此，筆者提出如下科學(xué)假說：在高糖、慢性炎癥刺激引起內(nèi)毒素增多的環(huán)境下，JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活進(jìn)而促進(jìn)血管纖維化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)采用2型糖尿病大鼠股動(dòng)脈纖維病變模型，應(yīng)用免疫組化、蛋白免疫印跡（Western blot）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）實(shí)時(shí)熒光定量等技術(shù)，從c-Jun氨基末端激酶（JNK1）蛋白的表達(dá)水平，JNK1蛋白的磷酸化水平，JNK1基因的表達(dá)水平及血管上皮細(xì)胞形態(tài)功能水平等方面多角度考察JNK1與2型糖尿病大鼠股動(dòng)脈纖維化的關(guān)系，并研究中藥桃仁的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠50只，清潔級(jí)，2月齡，體質(zhì)量160~200 g，由天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 桃仁，原材料檢驗(yàn)合格后，破碎，置多功能中藥提取罐中，煎煮2次，過濾3次，真空低溫濃縮，噴霧干燥，干法制粒，檢驗(yàn)合格后備用，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院顆粒劑藥房制備，每克顆粒劑相當(dāng)于生藥20 g。使用時(shí)將3 g桃仁顆粒劑溶解200 mL蒸餾水中，形成每毫升含生藥0.3 g的藥液備用。大鼠的等效劑量約為人體的6倍，生藥用藥劑量約為3.0 g/（kg·d），即顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 兔抗大鼠多克隆抗體（JNK1 BA1219），武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠多克隆抗體（p-JNK1 BS-17591r），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG二抗抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗，天津賽爾生物有限公司；Actin（5A7）mAb M20010內(nèi)參抗體，天津賽爾生物有限公司；Epgiadients PCR儀，Eppendorf公司；ABI7500 fast熒光定量PCR儀，Life Technologies公司。

1.4 造模方法及實(shí)驗(yàn)分組 造模方法：雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、早期干預(yù)組、桃仁高劑量組、桃仁低劑量組各10只；空白對(duì)照組10只普通飲食喂養(yǎng)，其余各組予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，誘導(dǎo)胰島素抵抗。4周后，禁食不禁水12 h，稱質(zhì)量。行腹腔靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg。第3、7天測(cè)血糖，血糖＞16．7 mmol/L為2型糖尿病鼠造模成功。此時(shí)空白對(duì)照組繼續(xù)普通飲食喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)10周[1-2]，進(jìn)行2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變?cè)炷＃渲性缙诟深A(yù)組予桃仁顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）灌胃。

2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變模型標(biāo)準(zhǔn)：前期實(shí)驗(yàn)表明，雄性SD大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后行腹腔靜脈注射STZ，可形成2型糖尿病鼠模型，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)10周后，可形成2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變模型[3-5]。本次實(shí)驗(yàn)中，為驗(yàn)證模型成功率，另取同批次雄性SD大鼠3只單獨(dú)分組，干預(yù)方法同模型對(duì)照組，2型糖尿病鼠模型造模成功10周后剝?nèi)‰p側(cè)股動(dòng)脈，福爾馬林溶液固定，光鏡下觀察，若見纖維帽，膠原纖維玻璃樣變，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，其下聚集大量泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，彈力纖維斷裂，甚至出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶，血栓形成，鈣鹽沉著，即證明2型糖尿病鼠股動(dòng)脈纖維病變模型制作成功（造模結(jié)果為陽性，見圖1）。這3只雄性SD大鼠不進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。

圖1 2型糖尿病鼠股動(dòng)脈纖維病變?cè)炷＝Y(jié)果（HE染色）Fig.1 Resultsof model building of femoral artery fiber lesion in type 2 diabetic rats（HE staining）

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 實(shí)驗(yàn)過程中空白對(duì)照組不予藥物干預(yù)，早期干預(yù)組從2型糖尿病造模成功后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束給予桃仁顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）灌胃，模型對(duì)照組從2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變?cè)炷３晒蠼o予0．9%生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，桃仁高劑量組從2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變?cè)炷３晒蠼o予桃仁顆粒劑水溶液20 mL/（kg·d）灌胃，低劑量組從2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變?cè)炷３晒蠼o予桃仁顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）灌胃。從2型糖尿病股動(dòng)脈纖維病變?cè)炷３晒筮B續(xù)藥物干預(yù)3周。

1.6 取材 藥物干預(yù)3周后，禁食24 h，用10%的水合氯醛3 g/kg麻醉，備皮，手術(shù)區(qū)皮膚消毒。根據(jù)股動(dòng)脈搏動(dòng)情況確定股動(dòng)脈的位置和走行方向，將皮膚沿股動(dòng)脈走向縱向切開，用紋式鉗把周圍組織鈍性分離開來，以暴露股動(dòng)脈鞘。用眼科鑷沿著血管走向鈍性分離出股動(dòng)脈約4～5 cm，兩端剪斷，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，平均分成兩部分，一部分采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，另一部分置于無菌凍存管中，-80℃冰箱保存。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 免疫組化檢測(cè)股動(dòng)脈JNK1的表達(dá) 標(biāo)本固定、包埋、切片，用4%多聚甲醛固定。經(jīng)70%乙醇30 min，80%乙醇 30 min，90%乙醇 30 min 2次，95%乙醇30 min 2次，100%乙醇30 min 2次，二甲苯透明30 min 2次，55℃石蠟中30 min 2次，用銅制模具包埋組織塊。將厚度5μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜。再經(jīng)過二甲苯脫蠟。后水化，抗原煮沸熱修復(fù)，封閉。滴加一抗：將兔抗鼠抗體稀釋到適當(dāng)濃度（按1：100稀釋），滴加稀釋的抗體。置濕盒中4℃孵育過夜。滴加二抗：滴加適量生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗工作液，37℃孵育10～30 min。經(jīng)PBS沖洗、滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育再?zèng)_洗。避光配置二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，復(fù)染，脫水，透明，封固，最后光鏡下觀察。

1.7.2 Western blot檢測(cè)股動(dòng)脈JNK1、應(yīng)激活化蛋白激酶1（p-JNK1）的表達(dá) 液氮低溫研磨組織。Modified RIPA buffer充分裂解，超聲波破碎組織。12 000 g，4℃離心15 min，取上清液。利用牛血清白蛋白（BSA）蛋白定量法，對(duì)各樣本的蛋白濃度進(jìn)行分析。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠電泳分離蛋白，配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠。取32μL總蛋白、8μL的 5×Loading Buffer，煮沸 3 min，立即冰置 3 min，上樣。100 V電壓電泳。電轉(zhuǎn)膜：將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙3片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。伯樂半干轉(zhuǎn)印儀器轉(zhuǎn)膜，15 V，40 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，切斷電源，取出雜交膜。封閉：用25 mLTBS洗膜5 min，室溫，搖動(dòng)。置膜于25 mL封閉緩沖液中1 h，室溫，搖動(dòng)。15 mL TBS/T洗3次（5 min/T）。與一抗的結(jié)合：在搖床上4℃輕輕搖動(dòng)過夜。洗去非特異結(jié)合的一抗。與二抗的結(jié)合：將上膜和下膜分別浸入含相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗的Blotto中，緩慢搖動(dòng)室溫孵育1 h。洗去非特異結(jié)合的二抗。在15 mLTBS中洗1次。用ECL液（KPL公司）顯色，GE自動(dòng)曝光系統(tǒng)檢測(cè)、攝像。

1.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)股動(dòng)脈JNK1基因表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)其中JNK1 mRNA的含量。采用Trizol法提取總RNA，RT-PCR采用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為12．5μLSYBRMix，1μLcDNA，上下游引物各1μL，ddH2O體積 9．5μL，合計(jì)25μL。儀器為ABIStep-plus系統(tǒng)。JNK1引物序列上游為TGATGTCTGCAATACCCAGGC，下游為TTCGTTAGTCTAGGCTGTGCC。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠股動(dòng)脈JNK1表達(dá)的免疫組化定位結(jié)果 JNK1主要表達(dá)于大鼠股動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，采用免疫酶標(biāo)法（ABC法）檢測(cè)大鼠股動(dòng)脈中JNK1表達(dá)情況（見圖2），空白對(duì)照組大鼠股動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞中有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變；模型對(duì)照組可見大量棕黃色物質(zhì)表達(dá)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。早期干預(yù)組和桃仁高劑量組可見黃色物質(zhì)呈陽性反應(yīng)，提示JNK1表達(dá)明顯下降，桃仁低劑量組可見大量黃色物質(zhì)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，提示JNK1表達(dá)無明顯下降。

圖2 大鼠股動(dòng)脈JNK1免疫組化結(jié)果（×400）Fig.2 Immunohistochemical resultsof JNK1 in rats femoral artery（×400）

2.2 大鼠股動(dòng)脈JNK1、p-JNK1的Western blot檢測(cè)結(jié)果 JNK1p-JNK1表達(dá)，5組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見表 1。

表1 治療后各組大鼠股動(dòng)脈JNK1表達(dá)的比較（±s）Tab.1 Comparison of JNK1 expression in thefemoral artery of each group after treatment（±s）

表1 治療后各組大鼠股動(dòng)脈JNK1表達(dá)的比較（±s）Tab.1 Comparison of JNK1 expression in thefemoral artery of each group after treatment（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01；與桃仁高劑量組相比，△△P＜0．01；與桃仁低劑量組相比，▲▲P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù) JNK1 p-JNK1早期干預(yù)組 10 0．477 6±0．069 0**##△△▲▲ 0．168 0±0．004 2**##△△▲▲低劑量組 10 0．585 4±0．008 1**#△△ 0．214 1±0．006 7**##△△高劑量組 10 0．513 1±0．009 0**## 0．177 1±0．005 8**##模型對(duì)照組 10 0．593 9±0．006 4** 0．223 1±0．010 8**空白對(duì)照組 10 0．467 5±0．006 2 0．157 8±0．003 9

2.3 大鼠股動(dòng)脈 JNK1、p-JNK1的 Western blot灰度值結(jié)果 見圖3。各組Western blot灰度值檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，圖像結(jié)合表1結(jié)果分析如下：JNK1：模型對(duì)照組大鼠JNK1表達(dá)高于空白對(duì)照組；早期干預(yù)組和桃仁高劑量組與模型對(duì)照組相比，JNK1表達(dá)明顯降低，且以早期干預(yù)組最為明顯；桃仁低劑量組與模型對(duì)照組相比，JNK1表達(dá)有所降低。p-JNK1：模型對(duì)照組大鼠p-JNK1表達(dá)高于空白對(duì)照組；早期干預(yù)組和桃仁高劑量組與模型對(duì)照組相比，p-JNK1表達(dá)明顯降低，且以早期干預(yù)組最為明顯；桃仁低劑量組與模型對(duì)照組相比，JNK1表達(dá)有所降低。

圖3 大鼠股動(dòng)脈JNK1/p-JNK1 Western blot灰度值Fig.3 Gray value of JNK1/p-jnk1 Western blot in the femoral artery of rats

2.4 大鼠股動(dòng)脈JNK1的RT-qPCR結(jié)果 大鼠股動(dòng)脈JNK1基因表達(dá)，5組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見表 2。

3 討論

目前認(rèn)為糖尿病大血管病變的病理改變主要為內(nèi)膜層及中膜層厚度增加，管腔狹窄，管壁順應(yīng)性降低，內(nèi)膜粥樣斑塊形成致管腔進(jìn)一步狹窄，直至完全閉塞產(chǎn)生臨床癥狀。國外研究[6]表明高血糖與高血脂的毒性作用、內(nèi)皮功能障礙、蛋白質(zhì)非酶糖基化等因素聯(lián)合作用于血管壁，可以導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖和膠原過度表達(dá)，這種高糖誘導(dǎo)的過度表達(dá)與血管纖維化及血管硬化高度相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗引起的相關(guān)病理改變和胰島素信號(hào)通路受損已成為2型糖尿病、代謝綜合征和血管病變?cè)缙诎l(fā)病的危險(xiǎn)因素[7]。

JNK在細(xì)胞、生產(chǎn)、凋亡、增殖和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用。目前認(rèn)為JNK參與了1型糖尿病的形成，誘導(dǎo)活化JNK通路可導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，并且JNK與胰島β細(xì)胞凋亡、胰島素基因表達(dá)障礙、胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。此外，研究表明[8-9]JNK的異常表達(dá)可影響轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的活性，進(jìn)而影響肺臟、腎臟及血管纖維化的進(jìn)程。2型糖尿病狀態(tài)下，活化的TGF-β1通過激活JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而引起Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成明顯增加并能促進(jìn)纖維連接蛋白（FN）的過度聚集，最終導(dǎo)致組織纖維化的產(chǎn)生。從動(dòng)物造模及實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，中晚期糖尿病大鼠存在明顯的下肢血管病變，其病理改變與纖維化有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，JNK在糖尿病大鼠股動(dòng)脈中明顯升高，可能是導(dǎo)致大血管纖維病變的分子機(jī)制。

桃仁為薔薇科植物桃或山桃的干燥成熟種子，可入中藥，也稱為“桃核仁”“南杏”，桃仁藥用首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，載其：“主瘀血血閉，癥痛邪氣，殺小蟲?！薄妒宠b本草》記載：“桃仁破血，潤大腸。”《名醫(yī)別錄》中記載桃仁：“止咳逆上氣，消心下堅(jiān)，除卒暴擊血，破癥痛，通脈，止痛?！薄侗静菥V目·果一·桃》中記載：“桃仁行血，宜連皮尖生用。”有破血行瘀，潤燥滑腸之功效。中醫(yī)認(rèn)為瘀血是糖尿病及其血管并發(fā)癥的重要病理基礎(chǔ)，活血化瘀藥能明顯降低糖尿病鼠大動(dòng)脈轉(zhuǎn)化生長因子-β、結(jié)締組織生長因子、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ含量，具備有效抑制糖尿病大血管向纖維化發(fā)展的傾向。現(xiàn)代研究證明[10-13]桃仁通過擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓、抗纖維化等發(fā)揮活血化瘀的作用。目前研究表明桃仁提取物對(duì)肝纖維化均有良好的防治作用，其抗組織纖維化的機(jī)制在于促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原和FN的降解[14]；此外桃仁對(duì)大鼠血液循環(huán)障礙及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也有明顯的抑制作用[10，15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥早期干預(yù)對(duì)糖尿病股動(dòng)脈纖維化有明顯預(yù)防作用，能有效抑制糖尿病血管病變的發(fā)展；在血管病變發(fā)生后，中藥干預(yù)3周，早期干預(yù)療效明顯，桃仁高劑量組療效良好，桃仁低劑量組療效欠佳，表明桃仁對(duì)糖尿病股動(dòng)脈纖維病變的抑制作用與用藥劑量及用藥時(shí)間成正相關(guān)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，桃仁可有效改善糖尿病股動(dòng)脈纖維病變，其作用機(jī)制可能是通過抑制JNK1基因的表達(dá)，降低JNK1蛋白的生成與表達(dá)，從而達(dá)到抑制股動(dòng)脈纖維化形成的目的。

表2 治療后各組大鼠股動(dòng)脈JNK1基因表達(dá)的比較（±s）Tab.2 Comparison of the JNK1 gene expression in the femoral artery of each group after treatment（±s）

表2 治療后各組大鼠股動(dòng)脈JNK1基因表達(dá)的比較（±s）Tab.2 Comparison of the JNK1 gene expression in the femoral artery of each group after treatment（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，**P＜0．01；與模型組相比，##P＜0．01；與桃仁高劑量組相比，△△P＜0．01；與桃仁低劑量組相比，▲▲P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） JNK1早期干預(yù)組 10 1．228 1±0．070 2**##△△▲▲桃仁低劑量組 10 1．991 1±0．067 8**##△△桃仁高劑量組 10 1．330 4±0．078 2**##模型對(duì)照組 10 2．081 2±0．075 4**空白對(duì)照組 10 1．006 2±0．063 5