楊 杰

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，張家口 075000）

慢性腎功能衰竭（CRF）是各種慢性腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)局，電解質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)、酸堿失衡以及貧血是其早期主要的臨床表現(xiàn)[1-3]。芹菜素（APG）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的天然存在的黃酮類化合物，在多種水果蔬菜中均含量豐富，王珂等[4]和王強(qiáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物對(duì)CRF大鼠具有一定的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)復(fù)制CRF模型大鼠并腹腔注射給予APG進(jìn)行治療，通過(guò)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)并對(duì)比正常對(duì)照組、模型組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，探討APG對(duì)CRF大鼠貧血和電解質(zhì)代謝紊亂的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）雄性SD大鼠（8周齡，220～260 g）購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2013-1-003]。飼養(yǎng)環(huán)境：23～25℃、相對(duì)濕度 55%～60%，光照周期 12 h：12 h。

1.2 藥物與試劑 芹菜素（陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：170329）；血清鐵（SI）、總鐵結(jié)合力（TIBC）測(cè)定試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：071128、070916）；鐵蛋白（FER）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定試劑盒（美國(guó)R&D公司，E01627）；血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿素（UA）測(cè)定試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)：201711012、201710025、201705023）；腺嘌呤（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模與給藥 取100只實(shí)驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、APG低劑量組[10 mg/（kg·d）]、APG中劑量組[20 mg/（kg·d）]、APG高劑量組[40 mg/（kg·d）]組，每組20只。復(fù)制CRF大鼠模型[6]：制備25%腺嘌呤溶液，連續(xù)灌胃21 d[250 mg/（kg·d）]以制備CRF大鼠模型，造模結(jié)局判斷[7]：SCr水平高于正常高值，腎臟組織呈現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)纖維化等病理性改變，即造模成功。造模完成后，APG各劑量組腹腔注射給藥治療（1次/日），正常對(duì)照組和模型組同步腹腔注射給予生理鹽水，療程28 d。

1.3.2 腎功能指標(biāo)檢測(cè) 麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血（不做抗凝處理），1 500 r/min離心10 min取血清，通過(guò)生化分析儀測(cè)定血清中BUN、SCr、UA含量。

1.3.3 腎臟指數(shù)的計(jì)算 稱量各組大鼠體質(zhì)量，麻醉后開(kāi)腹摘取兩側(cè)腎臟組織，生理鹽水沖洗干凈后稱量左側(cè)腎臟質(zhì)量，然后進(jìn)行計(jì)算，腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.4 貧血監(jiān)測(cè)指標(biāo) 參照1．3．2方法取血，血常規(guī)分析儀測(cè)定全血紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）；1 500 r/min離心10 min取血清，通過(guò)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清中SI、TIBC、FER含量。

1.3.5 電解質(zhì)測(cè)定 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并分離血清后通過(guò)化分析儀測(cè)定血清 K+、Na+、Ca2+、P3+含量。

1.3.6 腎臟組織病理學(xué)檢查 取右側(cè)腎臟組織，置4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，72 h后進(jìn)行石蠟包埋和切片，脫蠟水化處理后行常規(guī)HE染色[依次進(jìn)行乙醇梯度脫蠟、磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌、蘇木素染色5 min、0．5%乙醇鹽酸分色、伊紅染色 20s等步驟]，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用軟件SPSS18．0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）方式表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方法分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能檢測(cè)結(jié)果比較 模型組大鼠血清BUN、SCr、UA含量較正常對(duì)照組均顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，APG 中、高劑量組 CRF 大鼠血清經(jīng)治療28 d后BUN、SCr、UA含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05 或 P＜0．01）。見(jiàn)表 1。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)結(jié)果比較 模型組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，APG 高劑量組 CRF大鼠經(jīng)治療 28 d后體質(zhì)量升高（P＜0．05），APG 中、高劑量組腎臟指數(shù)顯著降低（P＜0．01）。見(jiàn)表 2。

2.3 各組大鼠貧血監(jiān)測(cè)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較 模型組大鼠 RBC、HGB、HCT、SI、TIBC、FER 較正常對(duì)照組均顯著降低（P＜0．01）；與模型組比較，APG 中、高劑量組 CRF大鼠經(jīng)治療 28 d后 HGB、HCT、SI、TIBC、FER顯著升高，且高劑量組RBC顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05 或 P＜0．01）。見(jiàn)表 3。

2.4 各組大鼠電解質(zhì)測(cè)定結(jié)果比較 模型組大鼠血清Ca2+含量較正常對(duì)照組顯著降低且K+、Na+、P3+含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，APG 中、高劑量組CRF大鼠經(jīng)治療28 d后血清Ca2+含量顯著升高（P＜0．05），P3+含量顯著降低且高劑量組 K+、Na+含量顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見(jiàn)表 4。

表1 各組大鼠BUN、SCr、UA測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.1 The measurement resultsof BUN，SCr，UA（±s）

表1 各組大鼠BUN、SCr、UA測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.1 The measurement resultsof BUN，SCr，UA（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

UA（mmol/L）正常對(duì)照組 20 5．87±1．36組別 動(dòng)物數(shù)（只）BUN（mmol/L）69．25± 9．14 66．31± 9．78模型組 20 25．01±3．75**134．93±34．52**112．75±1 126．17±37．09 98．36±2 115．83±26．28# 84．05±1 6．82**APG 低劑量組 20 20．16±3．94 2．94 APG 中劑量組 20 14．72±2．81##6．32##APG 高劑量組 20 11．58±2．37##104．25±23．86# 77．49±14．17##SCr（μmol/L）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.2 The measurement resultsof body weight and kidney index（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.2 The measurement resultsof body weight and kidney index（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

表3 各組大鼠貧血監(jiān)測(cè)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.3 The measurement resultsof anemia monitoring index（±s）

表3 各組大鼠貧血監(jiān)測(cè)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.3 The measurement resultsof anemia monitoring index（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

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2.5 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均未見(jiàn)異常；與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織呈現(xiàn)明顯的病理性改變，主要表現(xiàn)為腎小球數(shù)量減少、球囊粘連、囊腔擴(kuò)大、腎小管壞死、大量炎癥細(xì)胞和出現(xiàn)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等；較模型組，經(jīng)APG中、高劑量組治療28 d后CRF大鼠腎臟組織病變明顯改善，改善效果以高劑量組最為顯著。見(jiàn)圖1。

表4 各組大鼠電解質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.4 The measurement resultsof electrolyte index（±s）

表4 各組大鼠電解質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較（±s）Tab.4 The measurement resultsof electrolyte index（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

（mmol/L）正常對(duì)照組 20 4．79±0．46 140．62±1．46 2．38±0．31 1．57±0．11模型組 20 6．05±0．72**143．24±1．79**1．56±0．19**2．24±0．18**APG 低劑量組 20 5．86±0．97 142．93±2．08 1．72±0．15 2．09±0．35 APG 中劑量組 20 5．37±0．85# 142．05±1．63# 1．99±0．42# 1．91±0．27#APG 高劑量組 20 5．18±0．69##139．98±1．52# 2．02±0．29# 1．68±0．19##組別 動(dòng)物數(shù)（只）K+P3+（mmol/L）Na+（mmol/L）Ca2+（mmol/L）

圖1 腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×400）Fig.1 The histopathological examination resultsof renal tissue（HE，×400）

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)CRF發(fā)病率達(dá)568/100萬(wàn)，具有不可逆及持續(xù)進(jìn)展的特點(diǎn)，是主要致死原因之一[8]，是臨床上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一。高濃度腺嘌呤持續(xù)攝入是常用的CRF大鼠模型造模方法[7]，該方法制作的CRF大鼠模型異常新陳代謝與人類CRF臨床表現(xiàn)及病理改變相似[9]；該制作方法的機(jī)制主要與腺嘌呤代謝形成極難溶于水的2，8-二羥基腺嘌呤，沉積于腎小管并堵塞腎小管腔，影響氮質(zhì)化合物的排泄，導(dǎo)致氮質(zhì)血癥、毒素蓄積、電解質(zhì)代謝紊亂而最終引起腎功能衰竭[10]，此外還可能與2，8-二羥基腺嘌呤阻塞腎小管而引發(fā)腎臟組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。腎功能指標(biāo)（BUN、SCr、UA）異常、電解質(zhì)（P3+、K+、Na+、Ca2+）代謝紊亂、貧血以及腎臟組織病變是CRF的主要臨床表現(xiàn)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清BUN、SCr、UA顯著升高，Ca2+含量顯著降低且 K+、Na+、P3+含量顯著升高，貧血監(jiān)測(cè)指標(biāo)明顯異常，腎臟組織病理性改變，提示造模成功。

本實(shí)驗(yàn)采用腺嘌呤連續(xù)灌胃21 d的方法復(fù)制CRF模型大鼠，腹腔注射給予APG進(jìn)行干預(yù)治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)APG 20～40 mg/（kg·d）治療28 d能夠有效改善CRF大鼠腎功能（降低血清BUN、SCr、UA含量），降低腎臟指數(shù)，抑制腎臟組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)病變，提示APG對(duì)CRF大鼠腎臟組織損傷具有抑制作用。

腎性貧血主要表現(xiàn)為RBC數(shù)量降低，HGB、HCT 降低，SI、TIBC、FER 含量降低[13-14]。SI是 HGB合成的必需元素[15]，貧血的發(fā)生與HGB合成受阻密切相關(guān)，因此HGB水平是評(píng)價(jià)人體是否貧血的重要指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)APG 20～40 mg/（kg·d）治療28 d能夠有效提高CRF大鼠全血RBC、HGB、HCT水平和血清中SI、TIBC、FER含量，提示APG具有抑制CRF大鼠貧血癥狀的作用。

電解質(zhì)代謝紊亂也是CRF患者常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其中鈣磷代謝紊亂最常見(jiàn)并形成低鈣高磷血癥[17]，此外電解質(zhì)代謝紊亂還可誘發(fā)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、血管鈣化等[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)APG 20～40 mg/（kg·d）治療28 d能夠升高CRF大鼠血清Ca2+水平并降低 P3+、K+、Na+水平，說(shuō)明 APG 具有抑制CRF大鼠電解質(zhì)代謝紊亂的作用。

綜上所述，APG具有改善CRF大鼠貧血、電解質(zhì)紊亂的藥理學(xué)作用，可能是APG對(duì)CRF能夠起到一定保護(hù)作用的機(jī)制之一。