(南華大學(xué) 1.衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

以慢性炎癥、免疫抑制、缺氧以及代謝和生化改變?yōu)樘卣鞯哪[瘤微環(huán)境(tumor microenvironmen，TME)是影響腫瘤細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和進(jìn)化的環(huán)境[1]，酸度是腫瘤微環(huán)境的內(nèi)在特征，在腫瘤組織中非常常見(jiàn)。在生理?xiàng)l件下，惡性腫瘤與正常組織相比，表現(xiàn)出酸性細(xì)胞外環(huán)境，而細(xì)胞外的酸性環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞有重要作用。低氧條件下，腫瘤脈管系統(tǒng)紊亂，異質(zhì)血流和糖酵解增加(Warburg Effect)是實(shí)體瘤常見(jiàn)的特征，這常常導(dǎo)致酸中毒。腫瘤細(xì)胞可以將酸中毒作為信號(hào)以促進(jìn)它們的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中均存在ASIC1的異常表現(xiàn)。

1 ASIC1的結(jié)構(gòu)及分布

ASICs是一類可被胞外質(zhì)子激活的非選擇性陽(yáng)離子通道，屬于ENaC/DEG(上皮Na+通道/退化蛋白)通道家族成員[3]，可被細(xì)胞外質(zhì)子激活[4]，對(duì)Na+有著通透性。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)由4個(gè)基因編碼的ASIC亞基蛋白，包括ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4[3]。

ASIC1由500多個(gè)氨基酸組成，各亞基的氨基酸序列在物種間高度保守，對(duì)雞的ASIC1和單分子成像的結(jié)晶揭示了ASIC組裝為三聚體[3]，它們包含TM1和TM2兩個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)主要由半胱氨酸組成的胞外環(huán)，其N端和C端在胞內(nèi)。ASIC1a由ACCN2基因編碼，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有廣泛表達(dá)，而ASIC1b主要由ACCN1編碼。ASIC1a主要分布于中樞的大腦皮質(zhì)、海馬、小腦、松果體、杏仁核、上丘腦、脊髓等部位[5]，在味蕾細(xì)胞、外周軟骨細(xì)胞、人類造骨細(xì)胞中也有表達(dá)，在軟骨細(xì)胞中最為豐富。腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中也有ASIC1a的表達(dá)，ASIC1b只發(fā)現(xiàn)存在于外周背根神經(jīng)節(jié)中。

2 ASIC1的生物學(xué)功能和特性

ASIC1對(duì)Ca2+有特異性通透性[6]，還參與各種病理和生理過(guò)程，如腦缺血，癲癇發(fā)作，突觸可塑性，學(xué)習(xí)、記憶，傷害感受和疼痛等，腫瘤細(xì)胞甚至可以以酸中毒作為信號(hào)來(lái)促進(jìn)它們的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。

ASIC1半數(shù)最大活化所需的pH值在4.9到6.8之間[7]，所有ASICs亞基都能被阿米洛利抑制，狼蛛毒素(PcTx)也能通過(guò)促進(jìn)ASIC1a的脫敏狀態(tài)，特異性地抑制ASIC1a電流。

3 ASIC1在腫瘤中的作用機(jī)制

Ca2+是癌細(xì)胞遷移和侵襲的重要介質(zhì)。從機(jī)制上講，ASIC1是酸中毒通過(guò)鈣內(nèi)流介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)所必需的。酸中毒對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有破壞性，但腫瘤細(xì)胞已適應(yīng)酸性微環(huán)境，微環(huán)境中的低pH值能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]。ASIC1a通過(guò)參與酸中毒，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。在靜息狀態(tài)下，[Ca2+]i保持在一個(gè)較低水平，當(dāng)細(xì)胞處于酸性環(huán)境時(shí)，[Ca2+]i升高，pH越低，[Ca2+]i升高越明顯。ASIC1在細(xì)胞中能觸發(fā)Ca2+電流，升高[Ca2+]i，而抑制ASIC1的功能可減弱酸性環(huán)境對(duì)[Ca2+]i升高的刺激。ASIC1通過(guò)介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流調(diào)控酸性環(huán)境誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和NF-κB激活，并誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生[6]。ASIC1能感受細(xì)胞外酸性環(huán)境這一信號(hào)，并將其通過(guò)升高[Ca2+]i和RhoA活性的方式傳遞給細(xì)胞，以刺激癌細(xì)胞的EMT，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[7](圖1)。近年來(lái)，許多醫(yī)學(xué)研究試圖通過(guò)研究ASIC1在不同腫瘤中的表達(dá)水平及具體機(jī)制，從而明確腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程，最終達(dá)到治療腫瘤的目的。

圖1 ASIC1在腫瘤中的作用機(jī)制

4 ASIC1與腫瘤

4.1 ASIC1與肺癌

Wu等[10]發(fā)現(xiàn)ASIC1能在人肺癌A549細(xì)胞中功能性表達(dá)，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在pH 7.0的環(huán)境下存活率沒(méi)有受到影響，而在pH 6.5和pH 6.0時(shí)細(xì)胞存活率顯著增加，表明酸性細(xì)胞外介質(zhì)以pH依賴性的方式促進(jìn)A549細(xì)胞增殖。使用劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果同樣表明酸性胞外介質(zhì)也以pH依賴性的方式顯著刺激A549細(xì)胞遷移，確定了ASIC1在A549細(xì)胞增殖和遷移中的作用。過(guò)表達(dá)的ASIC1a不影響A549細(xì)胞在中性環(huán)境下的增殖和遷移，但它在pH 6.0的環(huán)境下顯著促進(jìn)A549細(xì)胞增殖和遷移[10]，在中性環(huán)境中，使用特異性ASIC1a抑制劑PcTX1和利用siRNA敲除ASIC1a，對(duì)A549細(xì)胞的增殖和遷移沒(méi)有影響。相反，酸性環(huán)境下使用PcTX1和敲除ASIC1a 卻能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，表明ASICs介導(dǎo)細(xì)胞外酸中毒誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖和遷移。為進(jìn)一步確定酸中毒的分子機(jī)制，Wu等[10]研究了細(xì)胞外酸中毒對(duì)A549細(xì)胞中[Ca2+]i的影響，發(fā)現(xiàn)低細(xì)胞外pH能顯著增加A549細(xì)胞中的[Ca2+]i，但特異性ASIC1a抑制劑PcTX1阻斷了這種作用，表明ASICs介導(dǎo)細(xì)胞外酸中毒所誘導(dǎo)的[Ca2+]i的增加，這些結(jié)果表明ASIC-鈣信號(hào)能介導(dǎo)細(xì)胞外酸中毒引起的肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，而ASIC1可作為肺癌的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

4.2 ASIC1與胰腺癌

在胰腺癌中表現(xiàn)出積極的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程，說(shuō)明了EMT在胰腺癌發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[11]。Zhu等[7]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR和定量實(shí)時(shí)RT-PCR法發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞系中ASIC1和ASIC3的mRNA與正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞(HPDE)相比顯著增加，同樣，免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與正常胰腺細(xì)胞相比，胰腺癌細(xì)胞中ASIC1和ASIC3的蛋白質(zhì)增加，免疫熒光測(cè)定顯示胰腺癌標(biāo)本中的ASIC1和ASIC3與癌旁組織相比也明顯增加。而同時(shí)或分別敲除ASIC1和ASIC3，應(yīng)用ASICs抑制劑阿米洛利或PxTC1后，PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中的標(biāo)記物如波形蛋白，N-鈣粘蛋白，Snail和ZEB1的表達(dá)降低，而E-鈣粘蛋白升高，這些結(jié)果表明ASIC1和ASIC3參與了酸性誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的EMT，并對(duì)其有促進(jìn)作用。為明確ASIC1是否通過(guò)調(diào)節(jié)[Ca2+]i影響酸度誘導(dǎo)的EMT，Zhu等[7]通過(guò)對(duì)比不同pH下胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]i后發(fā)現(xiàn)，與正常pH相比，酸性環(huán)境下PANC-1和BxPC-3細(xì)胞的[Ca2+]i以pH依賴性的方式升高，同時(shí)，敲低ASIC1或ASIC3能顯著減弱[Ca2+]i升高，并且也能被阿米洛利預(yù)處理所阻斷。這些結(jié)果表明，激活A(yù)SIC1和ASIC3能使酸性微環(huán)境喚起[Ca2+]i的升高。RhoA屬于G蛋白家族，且能被[Ca2+]i激活。pH升高時(shí)，PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中RhoA的活性明顯升高，相反敲低ASIC1或使用阿米洛利對(duì)ASIC1進(jìn)行抑制，酸性環(huán)境下的RhoA活性顯著降低。此外，用BAPTA-AM這一鈣螯合劑能降低酸誘導(dǎo)的RhoA活性，敲低RhoA也能顯著抑制酸性誘導(dǎo)的EMT并削弱胰腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，故通過(guò)ASIC1調(diào)節(jié)的酸誘導(dǎo)EMT的[Ca2+]i信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能有一部分歸因于RhoA信號(hào)傳導(dǎo)的激活。因此ASIC1可能成為胰腺癌治療干預(yù)的目標(biāo)，而針對(duì)[Ca2+]i或其下游效應(yīng)器RhoA為目標(biāo)可能為胰腺癌提供更可行的治療策略。

4.3 ASIC1與胃癌

Zhang等[12]通過(guò)RNA測(cè)序檢測(cè)胃癌患者正常胃組織和胃癌組織中差異表達(dá)的基因，并通過(guò)實(shí)時(shí)PCR進(jìn)一步證實(shí)了ASIC1和自噬相關(guān)蛋白5(ATG5)在胃癌細(xì)胞SGC-7901中表達(dá)。在SGC-7901細(xì)胞中分別沉默ATG5和ASIC1，SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)被顯著抑制，表明ATG5或ASIC1的下調(diào)能抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。敲低ASIC1后，SGC-7901細(xì)胞中的ATG5表達(dá)水平降低，而酸處理能夠補(bǔ)救因ASIC1沉默導(dǎo)致的ATG5的下調(diào)。這表明ASIC1通過(guò)激活胃癌細(xì)胞中的ATG5來(lái)上調(diào)自噬。而在小鼠模型中，ASIC1下調(diào)延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間并降低了腫瘤體積。這些數(shù)據(jù)表明對(duì)ASIC1的表達(dá)或活性的抑制可通過(guò)抑制自噬而成為一種新的胃癌靶向療法，并且可能對(duì)廣泛的多種癌癥的治療產(chǎn)生影響。

4.4 ASIC1與肝癌

Jin等[9]通過(guò)免疫組化法測(cè)定了15組肝癌組織和癌旁組織中ASIC1a蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中的蛋白水平明顯高于癌旁組織，肝癌伴術(shù)后轉(zhuǎn)移患者的轉(zhuǎn)移率高于未轉(zhuǎn)移的患者，且與晚期臨床分期相關(guān)。在pH 6.5的環(huán)境下培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，測(cè)定ASIC1a的mRNA和蛋白含量，發(fā)現(xiàn)其顯著高于在pH 7.4和pH 6.0環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞，提示中度酸性細(xì)胞外環(huán)境能促進(jìn)ASIC1a的表達(dá)。沉默ASIC1a后，ASIC1a的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)，而進(jìn)一步的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默ASIC1a能抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。提示ASIC1a參與肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移，并發(fā)揮重要作用。

Jin[13]進(jìn)一步探討了肝癌與ASIC1a表達(dá)水平之間的臨床相關(guān)性。在測(cè)定了90個(gè)肝癌組織中ASIC1a的mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)其均上調(diào)，而敲除ASIC1a后肝癌細(xì)胞停滯于G1/S期，并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖，作為Wnt/β-catenin/LEF-TCF靶基因Osx、Runx2、c-Myc和Cyclin的表達(dá)水平也降低，表明ASIC1a可能通過(guò)β-catenin/LEF-TCF軸抑制肝癌細(xì)胞增殖。Jin[26]還通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)，ASIC1a敲除后不僅降低了總β-catenin的表達(dá)水平，顯著抑制了肝癌細(xì)胞中β-catenin的核積累，還導(dǎo)致了β-catenin調(diào)節(jié)劑GSK3β被激活，β-catenin磷酸化。也就是說(shuō)，在酸性微環(huán)境中，ASIC1a可以保護(hù)β-catenin免于磷酸化和泛素化，幫助β-catenin核積累，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。因此，ASIC1a既能促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲與遷移，可能也是肝癌的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志物，而充分了解ASIC1a在人類癌癥中的確切作用可能為開(kāi)發(fā)新的治療方法提供機(jī)會(huì)。

Zhang等[14]進(jìn)一步測(cè)定了肝癌中ASIC1a的表達(dá)水平，利用免疫印跡法在8組肝癌組織和癌旁組織中檢測(cè)ASIC1a的表達(dá)，結(jié)果顯示ASIC1a在肝癌組織中高度表達(dá)，與之前的研究一致，這些數(shù)據(jù)表明ASIC1a上調(diào)與HCC的腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)。而通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法研究了ASICs在耐藥性肝癌細(xì)胞Bel7402/FU和HepG2/ADM中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ASIC1a表達(dá)顯著上調(diào)，但ASIC2,3和4表達(dá)沒(méi)有明顯增加。在耐藥性肝癌細(xì)胞中，ASIC1a僅在其存在于膜上的情況下發(fā)揮其作用，但pH 6.5時(shí)的ASIC1的表達(dá)高于pH 7.4時(shí)的表達(dá)，表明酸性細(xì)胞外pH不僅是ASIC1a的激活劑，而且還促進(jìn)其向膜的運(yùn)輸。這些數(shù)據(jù)顯示，ASIC1a上調(diào)可能與肝癌中的腫瘤耐藥性也呈正相關(guān)。

4.5 ASIC1與膠質(zhì)瘤

在整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)中，ASIC1廣泛表達(dá)，其在學(xué)習(xí)、記憶，傷害感受和疼痛等病理和生理過(guò)程中起重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，ASICs與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)，它能表達(dá)ENaC/DEG家族的多個(gè)成員，并特征性地表現(xiàn)出阿米洛利敏感的陽(yáng)離子電流[15]。在體外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖會(huì)受到低pH值的影響[16]。Tian等[17]將膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系分為R54系和R8系，這兩種細(xì)胞系都能功能性表達(dá)ASIC1a的ACCN2，但表達(dá)ASIC1b的ACCN3的能力較弱，無(wú)法檢測(cè)。在分析數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)的ASIC1a對(duì)提高患者生存率具有實(shí)質(zhì)性影響，而調(diào)整ASIC1a的pH敏感性，能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞具備感知周圍酸性環(huán)境的能力，改善其預(yù)后。

4.6 ASIC1與乳腺癌

NF-κB是一種多效轉(zhuǎn)錄因子，可以被包括低細(xì)胞外pH在內(nèi)的多種刺激而激活。Gupta等[18]通過(guò)免疫印跡、基因測(cè)定和免疫熒光染色確定酸中毒能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中的NF-κB活化。在酸性條件下產(chǎn)生的ROS可以使PTEN-AKT信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子失活，從而激活A(yù)KT和PDK1，導(dǎo)致NF-κB活化。Gupta等[6]還利用異種移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)ASIC1的抑制劑如阿米洛利和PcTx-1能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，減輕腫瘤重量，并可能作為癌癥治療的潛在靶標(biāo)。ASIC1能調(diào)節(jié)Ca2+這一癌細(xì)胞遷移和侵襲的重要介質(zhì)[19]，而Ca2+能顯著抑制ROS的產(chǎn)生，提示ASIC1對(duì)于酸性條件下ROS的產(chǎn)生至關(guān)重要。敲除ASIC1可以消除酸中毒誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，使用ASIC1抑制劑后也能抑制酸中毒誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，重新表達(dá)后的ASIC1能恢復(fù)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，而敲除ASIC1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生沒(méi)有影響，故在酸中毒中ASIC1能特異性調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生。ASIC1是酸中毒引起的ROS產(chǎn)生所必需的，其可能為酸性微環(huán)境下調(diào)節(jié)AKT活化的中心分子。了解ASIC1介導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生以及相關(guān)信號(hào)通路的激活將為腫瘤細(xì)胞在酸性腫瘤微環(huán)境下的侵入和轉(zhuǎn)移提供新見(jiàn)解，并可能作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

4.7 ASIC1與透明細(xì)胞癌

Li等[20]通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白質(zhì)印跡分析，分別測(cè)定了ASIC1在腎透明細(xì)胞癌(CCRCC)組織中的mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，評(píng)估了75例CCRCC患者的腫瘤組織和相鄰正常組織中ASIC1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)正常腎臟和CCRCC樣品中都能檢測(cè)到ASIC1表達(dá)，但CCRCC組織中ASIC1和mRNA的表達(dá)明顯低于正常腎組織，且其表達(dá)與腫瘤分期和患者年齡無(wú)相關(guān)性，但與更高的腫瘤分級(jí)相關(guān)。故ASIC1可能潛在地作為新的生物標(biāo)志物，甚至是CCRCC治療靶點(diǎn)。而進(jìn)一步明確ASIC1在CCRCC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，將會(huì)為ASIC1在CCRCC的診斷和治療提供新的思路。

5 展 望

ASIC1作為細(xì)胞外質(zhì)子的關(guān)鍵受體，參與涉及酸中毒在內(nèi)的多種病理生理過(guò)程，最終參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其在腫瘤中的作用得到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。目前，關(guān)于ASIC1與腫瘤的研究仍處于起始階段，其在腫瘤中的具體調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚。因此，深入探討ASIC1在不同腫瘤中的作用、確切的臨床意義及應(yīng)用前景，有助于將ASIC1作為靶點(diǎn)應(yīng)用于腫瘤的早期診斷，并為腫瘤治療提供新方向。