(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科, 陜西 西安 710000)

新生兒疾病篩查是指對(duì)新生兒進(jìn)行先天性疾病及遺傳性疾病進(jìn)行群體篩檢，以保障兒童正常的體格和智能發(fā)育。苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是一種常染色體隱性遺傳代謝性疾病，是由于體內(nèi)苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)活性降低導(dǎo)致苯丙氨酸向酪氨酸代謝受阻，從而導(dǎo)致患兒智力低下和生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。在我國(guó)，患兒苯丙酮尿癥的發(fā)病率已達(dá)0.01%[1]，已列為新生兒常規(guī)檢查項(xiàng)目之一。苯丙酮尿癥可被治療，通過(guò)對(duì)新生兒開(kāi)展主要疾病篩查工作，進(jìn)而提高治愈率，以防止嚴(yán)重后果的發(fā)生[2-3]。而MS/MS是一種靈敏度和特異性均很高的快速分析法, 可實(shí)現(xiàn)樣本中多種目的樣的同時(shí)測(cè)定，并且能夠?qū)⒃\斷的假陰性和假陽(yáng)性率大大降低。本文主要研究MS/MS在篩查新生兒苯丙酮尿癥中的效果，現(xiàn)將結(jié)果整理如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年3月至2015年12月共采集標(biāo)本9000例，健康新生兒組男6000例，女2998例，共8998例，臨床疑似PKU患者2例。(Phe和Tyr的正常值范圍是通過(guò)檢測(cè)健康嬰幼兒血中PHe和Tyr的濃度來(lái)確定的。)臨床表現(xiàn)為智力相對(duì)于健康嬰兒偏低。按《新生兒疾病查技術(shù)規(guī)范》[4]采集樣本。標(biāo)本來(lái)源于出生大于3天，哺乳至少達(dá)到3次的嬰兒，于足跟部采血，用專(zhuān)用濾紙收集采集到的血樣，自然干燥，然后將其置于塑料袋內(nèi)，為保證不被污染需將其進(jìn)行封口并保存于-20 ℃冰箱中于一周內(nèi)檢驗(yàn)即可。

1.2 儀器和試劑

PKU 檢測(cè)指標(biāo)為新生兒干濾紙血片樣本中的Phe和Tyr濃度，采用MS/MS檢驗(yàn)分析法，所用的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)為3200QTRAP。MS/MS所用到的非衍生化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。實(shí)驗(yàn)中所用到的Phe和Tyr標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自美國(guó)sigma公司。

1.3 MS/MS法

測(cè)定前先用打孔器將采血濾紙打成3 mm的圓形濾紙，將其置于96孔板中，每孔加入用Phe和Tyr同位素標(biāo)記的甲醇溶液100 L，密封，45 ℃以650轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩50 min，室溫放置30 min后轉(zhuǎn)移80 L置于另一個(gè)新的96孔板中上樣檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)將自動(dòng)進(jìn)樣設(shè)置為每次進(jìn)樣20 L，測(cè)定時(shí)選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，每個(gè)樣品的測(cè)試時(shí)間約為2 min。

1.4 資料分析

采用定量分析軟件ChemoView1.0, 根據(jù)Phe 和Tyr同位素標(biāo)記和離子峰強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后再計(jì)算出相應(yīng)樣品Phe和Tyr的濃度。

1.5 結(jié)果判定

通過(guò)檢測(cè)健康新生兒血液中Phe和Tyr濃度，并根據(jù)本科室檢測(cè)的具體情況，將新生兒樣本干濾紙血片中的 Phe 濃度陽(yáng)性切值定為120 mol/L，同時(shí)Phe/Tyr的比值要大于等于3.5。即測(cè)得血 Phe濃度≥120 mol/L時(shí)Phe/Tyr的比值大于等于3.5，則需召回病例進(jìn)行復(fù)查，若Phe仍大于120 mol/L，且Phe/Tyr的比值大于3.5。則可認(rèn)為是可疑 PKU 陽(yáng)性病例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍

MS/MS法檢測(cè)Phe的線性范圍為 25.3～898.5 mol/L，Tyr的線性范圍為39.60～260.07 mol/L，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析新生兒患者在男、女之間Phe和Tyr的濃度均無(wú)顯著性差異(P=0.345)

2.2 平均回收率和變異系數(shù)

MS/MS法檢測(cè)新生兒血中Phe濃度的平均回收率為97.8%, Tyr濃度的平均回收率為96.5%，具體指標(biāo)見(jiàn)下表(表1)。

表1 MS/MS法檢測(cè)新生兒血中Phe和Tyr的回收率及變異系數(shù) (%)

2.3 健康新生兒和臨床疑似PKU新生兒全血Phe和Phe/Tyr比值的比較

MS/MS法檢測(cè)健康新生兒全血Phe的濃度為(43.5±2.1) mol/L，經(jīng)MS/MS法檢測(cè)，最終確定PKU陽(yáng)性2例，其PHe，Tyr及兩者比值見(jiàn)下表(表2)。同時(shí)計(jì)算得健康新生兒全血Phe/Tyr<3.5, 陽(yáng)性PKU組Phe/Tyr>3.5。

表2 MS/MS法顯示PKU新生兒患者Phe，Tyr及兩者比值

注：標(biāo)本號(hào) “1、2”代表PKU陽(yáng)性的2例患者

3 討 論

PKU是一種常染色體隱性遺傳代謝性疾病，是由于體內(nèi)PAH活性降低導(dǎo)致苯丙氨酸向酪氨酸代謝受阻，導(dǎo)致血液中甚至尿中的苯丙氨酸濃度升高，而高濃度的苯丙氨酸會(huì)影響腦部發(fā)育，導(dǎo)致患兒智力低下和生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。PKU又稱(chēng)為苯丙氨酸羥化酶缺乏癥(phenylalanine hydroxylase deficiency)，是氨基酸代謝性疾病中最常見(jiàn)的類(lèi)型，苯丙氨酸滿足人體生長(zhǎng)和代謝的需要，但高濃度的苯丙氨酸，及低濃度的酪氨酸都將嚴(yán)重影響患兒的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。全球發(fā)病率約為1/1.5萬(wàn)，隨民族和地區(qū)而不同，而我國(guó)的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到了0.1%。其臨床癥狀一般為：患兒在剛出生時(shí)一般會(huì)表現(xiàn)為正常，但是也存在一些患兒會(huì)出現(xiàn)喂養(yǎng)困難、嘔吐、脾氣暴躁易發(fā)怒等非特異性癥狀，但伴隨著進(jìn)奶后血中苯丙氨酸及其代謝產(chǎn)物的升高，到3～5個(gè)月開(kāi)始會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢，皮膚蒼白的癥狀，并且由于合成的黑色素減少，患兒的頭發(fā)會(huì)由黑色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，并且經(jīng)患兒排出的汗液及尿液中有特殊的鼠臭味，伴有濕疹[5]。但是該病若在早期發(fā)現(xiàn)并給予積極治療的話，兒智力發(fā)育可以完全正常，是少數(shù)幾種可以通過(guò)早期診斷、治療預(yù)防其智能障礙出現(xiàn)的疾病之一[6]。

研究證明，全血中苯丙氨酸的濃度對(duì)于PKU 的早期篩查，診斷和治療等具有極其重要的意義[7,8]。PKU的篩查和檢驗(yàn)的方法有多種，目前主要包括細(xì)菌抑制法，熒光法，比色法，高效液相色譜法，MS/MS法，高效毛細(xì)管電泳法等[9,10]。相對(duì)于其他方法，MS/MS的最大優(yōu)勢(shì)就是能夠?qū)⒃\斷的假陰性和假陽(yáng)性率大大降低, 它的實(shí)現(xiàn)主要取決于MS/MS在特異性和靈敏度方面的顯著優(yōu)勢(shì), 而只有對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考核才能夠確保這些優(yōu)勢(shì)能實(shí)際應(yīng)用于臨床實(shí)踐。實(shí)施考核時(shí), 應(yīng)該重點(diǎn)考察方法的特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。其次應(yīng)該進(jìn)行方法驗(yàn)證。取一定已知結(jié)果的陽(yáng)性和陰性樣本, 打亂后應(yīng)用MS/MS法進(jìn)行分析, 然后將譜篩查結(jié)果同已知結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，來(lái)對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

由于MS/MS可最大程度的減少假陽(yáng)性率，故目前多采用這種方法對(duì)新生兒苯丙酮尿癥進(jìn)行篩選。本研究中，我們采用MS/MS對(duì)血中Phe濃度進(jìn)行了測(cè)定，此法顯示出高效、快速、靈敏度高，特異性好，檢測(cè)時(shí)間短，不需衍生化處理。線性范圍寬，精密度高，重復(fù)性好，用血量少，在臨床上，尤其對(duì)新生兒苯丙酮尿的篩選意義重大，有助于其早期診斷，可提高其治愈率。但由于樣本量有限，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管MS/MS有很多優(yōu)勢(shì)，但并不能完全取代傳統(tǒng)的篩查方法。隨著其日益成熟，MS/MS將有可能為更多的疾病進(jìn)行分析篩查。