(南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院1.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，2.腎內(nèi)科，3.肝膽外科，湖南 郴州423000)

糖皮質(zhì)激素在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮強(qiáng)有效的調(diào)節(jié)作用[1]，可抑制多種免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、肥大細(xì)胞等激活和趨化，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，并抑制炎癥部位一系列炎癥介質(zhì)的釋放[2]。糖皮質(zhì)激素在臨床治療炎癥[3]和自身免疫疾病[4]的效果明確，而激素介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制并未完全闡明。幼稚CD4+T細(xì)胞可分化為1型輔助性T細(xì)胞(Type 1 T helper cells，Th1)、Th2、Th17等細(xì)胞[5]。其中Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)等細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答[6]；Th2細(xì)胞參與細(xì)胞外病原體的清除[7-8]，Th17細(xì)胞通過產(chǎn)生標(biāo)志性細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥免疫應(yīng)答[9]。本文通過地塞米松體外72 h處理外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，探討其對健康人外周血輔助性T細(xì)胞亞群分布、增殖、凋亡、功能及轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集健康志愿者外周血，排除人類免疫缺陷病毒、梅毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等感染性疾病，且近期未使用糖皮質(zhì)激素的健康志愿者作為本次研究納入對象。該研究在南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會和志愿者知情同意下進(jìn)行。本次研究對象共45例，其中男37例，女8例；年齡19～47歲，平均(30.10±5.77)歲。

1.2 主要試劑

LIVEDEAD為Intitrogen公司生產(chǎn)；鼠抗人趨化因子受體6(Chemokine receptor 6，CCR6)PE-Cyanine7 (11A9)、T盒轉(zhuǎn)錄因子(T-box expression in T cells，T-bet) PE (eBio4B10)、CXC趨化因子受體3(C-X-C chemokine receptor type3,CXCR3) PE-610 (CEW33D)、脫中胚蛋白(Eomesodermin，Eomes)-APC (WD1928)、CD3 FITC (UCH71)、CD3 APC-eFluor 780 (SK7)、細(xì)胞核相關(guān)抗原(nuclear-associated antigen ki-67，ki-67)-PE-eFluor 610(20Raj1)購自eBioscience公司；鼠抗人CD4 BUV-737 (SK3)、CD8 APC-CY7 (SK1)、IFN-γ PE-CF (B27)、Granzyme B PE (GB11)、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-PE凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences公司；Cytofix/Cytoperm、Fixation/Permeabilization solution kit購自BD Biosciences公司；Fixation/Permeabilization Reagents、Human TruStain FcXTM(Fc Receptor Blocking Solution)、Foxp3/Transcription Factor 染色液試劑購自eBioscience公司；地塞米松、佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)為Sigam-Aldricha公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

應(yīng)用MoFlo XDP流式細(xì)胞分選儀(美國Beckman公司)獲取并分析細(xì)胞，軟件FlowJo V10.0分析流式數(shù)據(jù)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 采集健康志愿者外周血6～10 mL，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心分離PBMCs，凍存液凍存于-196 ℃液氮罐中備用。細(xì)胞解凍后，加5 mL R1640培養(yǎng)基洗去凍存液，用1 mL含10%胎牛血清的R1640完全培養(yǎng)基(Gibco)重懸細(xì)胞，并置于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。細(xì)胞活性恢復(fù)后計數(shù)并將同一樣本按1×106個細(xì)胞每孔，分為地塞米松組(終濃度為1×10-7mol/L)、對照組(細(xì)胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng))并種于96孔平底板中，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中72 h。

1.4.2 細(xì)胞表面染色 將上述樣本轉(zhuǎn)移至96孔V底板， 100 μL每孔live/dead (工作濃度1∶1 000)重懸，室溫避光孵育30 min 。細(xì)胞染色時先染含5 % Human TruStain FcXTM抗體懸液25 μL每孔，4 ℃孵育5 min，以阻斷Fc非特異性結(jié)合；按總體積50 μL每孔染相應(yīng)的抗體CD3、CD4、CXCR3、CCR6、CD8混勻后，4 ℃孵育30 min，700×g離心4 min。凋亡檢測時，據(jù)試劑盒說明書染Annexin V、7-AAD抗體，常溫孵育15 min，400 μL試劑盒相應(yīng)緩沖液重懸后，一小時內(nèi)檢測。

1.4.3 胞內(nèi)細(xì)胞因子刺激 PBMCs用地塞米松處理72 h后轉(zhuǎn)移至96孔U底板，用PMA (50 ng/mL)加Ionomycin (1 μg/mL )再刺激4～6 h，其中刺激細(xì)胞1 h后加Golgistop(工作濃度1∶1 500)阻斷胞內(nèi)細(xì)胞因子釋放到胞外，5 h后檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)。

1.4.4 胞內(nèi)細(xì)胞因子染色 因PMA刺激會導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞表達(dá)減少，因而使用CD8-T細(xì)胞群反設(shè)門為CD4+T細(xì)胞。Fixation/Permeabilization solution 100 μL每孔重懸細(xì)胞后4 ℃避光孵育20 min，洗滌細(xì)胞兩次后，按上述染色步驟，染抗IFN-γ、GzmB抗體，并流式檢測。

1.4.5 核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子染色 細(xì)胞經(jīng)表面抗體染色后，使用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 100 μL每孔室溫避光孵育40 min。洗滌細(xì)胞后，按上述染色步驟，染抗T-bet、Eomes或ki-67抗體，并流式檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 地塞米松體外處理增加CD4+T細(xì)胞的頻數(shù)

復(fù)蘇健康人PBMCs 23例，按照細(xì)胞數(shù)1×106個每孔，將同一細(xì)胞分為對照組與地塞米松處理組。地塞米松處理PBMCs 72 h后，PBMCs經(jīng)流式抗體表面染色檢測發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，地塞米松處理增加CD4+T細(xì)胞的比例(P<0.01，表1)。

表1 地塞米松處理組與對照組各表型的比例 (%)

與對照組比較，aP<0.01,bP<0.05

2.2 地塞米松體外處理改變輔助性T細(xì)胞的分布

為明確地塞米松體外72 h處理對CD4+T細(xì)胞亞群的影響，進(jìn)一步分析Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞的比例變化(圖1，表1)時發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，地塞米松刺激后可使Th2、Th17細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，而Th1細(xì)胞顯著降低(P<0.01)。

2.3 地塞米松體外處理抑制Th1細(xì)胞的功能

PBMCs經(jīng)佛波酯和離子霉素體外再刺激6 h后，流式抗體胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(圖2)分析發(fā)現(xiàn)：地塞米松刺激Th1細(xì)胞后，其功能性因子IFN-γ和GzmB的表達(dá)顯著減少(P<0.01，表1)。

2.4 地塞米松體外處理對Th1細(xì)胞增殖與凋亡的影響

細(xì)胞破核染色后檢測增殖標(biāo)記ki-67的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)地塞米松處理對Th1細(xì)胞表達(dá)ki-67的比例變化無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3A，表1)。細(xì)胞刺激72 h后直接染Annexin V、7-AAD抗體檢測細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)地塞米松處理后Th1細(xì)胞上早期凋亡細(xì)胞比例無明顯差異，晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05，圖3B，表1)。

圖1 地塞米松影響輔助性T細(xì)胞亞群分布輔助性T細(xì)胞的流式設(shè)門策略，CXCR3+CCR6-定義為Th1細(xì)胞、CXCR3-CCR6-定義為Th2細(xì)胞、CXCR3-CCR6+定義為Th17細(xì)胞(n=23)

2.5 地塞米松體外處理抑制Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄

PBMCs經(jīng)核內(nèi)染色(圖4)，發(fā)現(xiàn)地塞米松處理后Th1細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet無統(tǒng)計學(xué)差異，而Eomes表達(dá)顯著減少(P<0.01，表1)，且Eomes/T-bet比值也顯著下調(diào)(P<0.01，表1)。

圖2 地塞米松對Th1細(xì)胞上功能性細(xì)胞因子IFN-γ、GzmB表達(dá)的影響A：Th1細(xì)胞上IFN-γ表達(dá)的典型流式圖(n=11)；B：Th1細(xì)胞上GzmB表達(dá)的典型流式圖(n=11)

圖3 地塞米松對Th1細(xì)胞增殖、凋亡的影響A：Th1細(xì)胞上ki-67表達(dá)的典型流式圖(n=11)；B：Th1細(xì)胞早期凋亡(Annexin V+7-AAD-)，晚期凋亡細(xì)胞(Annexin V+7-AAD+)的典型流式圖(n=10)

圖4 地塞米松對轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes表達(dá)的影響A：Th1細(xì)胞上T-bet表達(dá)的典型流式圖(n=11)；B：Th1細(xì)胞上Eomes表達(dá)的典型流式圖(n=11)

3 討 論

在本文中，與對照組相比，地塞米松體外72 h處理增加CD4+T細(xì)胞的比例，顯著減少Th1細(xì)胞，增加Th2、Th17細(xì)胞的比例。有研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可抑制Th1細(xì)胞免疫，促進(jìn)Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答[10]，Zhao等[11]研究也證實，在體外實驗中地塞米松可增加Th17細(xì)胞的頻率。表明地塞米松可改變細(xì)胞亞群的比例，減少Th1細(xì)胞、并促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2、Th17細(xì)胞分布。

T-bet、Eomes為調(diào)控Th1細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，T-bet高表達(dá)于Th1細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞分化并促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)。體外實驗中激活的Th1細(xì)胞也可表達(dá)Eomes[12]，當(dāng)T-bet缺失時，Eomes對IFN-γ的產(chǎn)生以及Th1細(xì)胞的發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用。而Th1細(xì)胞可誘導(dǎo)GzmB表達(dá)，GzmB作為胞外蛋白酶在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，胞外GzmB的高表達(dá)與多種炎癥性疾病明顯相關(guān)[13-14]。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes的表達(dá)與調(diào)節(jié)編碼效應(yīng)細(xì)胞因子如IFN-γ，以及編碼重要細(xì)胞溶解功能如穿孔素、GzmB的基因表達(dá)有關(guān)[15]。

檢測功能性因子的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：地塞米松體外處理后，Th1細(xì)胞IFN-γ、GzmB表達(dá)減少。有研究證實地塞米松顯著減少IFN-γ的表達(dá)[3]，地塞米松也可阻斷GzmB的合成以及激活并影響其活性[16]。IFN-γ、GzmB是Th1細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子，提示地塞米松72 h處理可抑制Th1細(xì)胞的功能，從而使得Th1細(xì)胞功能受損。

Ki-67是表達(dá)于細(xì)胞周期G1、G2、S期，但不表達(dá)于M期的核抗原，已被廣泛用作細(xì)胞增殖的標(biāo)志。細(xì)胞凋亡是一個調(diào)控良好的細(xì)胞死亡過程，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的發(fā)育和維持中具有重要作用，Annexin V和7-AAD常用于鑒定細(xì)胞凋亡。本研究檢測細(xì)胞增殖和凋亡的實驗結(jié)果表明，地塞米松體外處理不影響Th1細(xì)胞的增殖，但能顯著促進(jìn)Th1細(xì)胞的凋亡，與Kailin Xing 等[17]研究結(jié)果一致。

T-bet、Eomes是Th1細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子，緊接著檢測轉(zhuǎn)錄因子水平的變化發(fā)現(xiàn)：地塞米松72 h處理后，Th1細(xì)胞上T-bet的表達(dá)無明顯改變，但Eomes的表達(dá)以及Eomes/T-bet的比值顯著減少。已有研究表明：炎性條件下，地塞米松可降低T-bet mRNA的表達(dá)水平[18]。而T-bet也參與調(diào)控濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular help T cell，Tfh)分化、發(fā)育，本研究中Th1細(xì)胞T-bet的表達(dá)無明顯改變可能是地塞米松作用于除Th1細(xì)胞之外的另一群細(xì)胞如Tfh細(xì)胞，主要減少其T-bet的表達(dá)，該猜想仍需進(jìn)一步研究證實。Eomes、Eomes/T-bet的比值在Th1細(xì)胞中顯著降低，提示地塞米松可抑制Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平，打破Eomes與T-bet之間的轉(zhuǎn)錄平衡，使得Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄功能受損。轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes調(diào)節(jié)IFN-γ、GzmB表達(dá)，而IFN-γ又可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，故轉(zhuǎn)錄水平受損將影響特異性細(xì)胞因子的表達(dá)，而特異性細(xì)胞因子受抑制后又可反過來影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[19]。

綜上所述，地塞米松體外干預(yù)健康人外周淋巴細(xì)胞可促進(jìn)Th1細(xì)胞凋亡從而減少Th1細(xì)胞的比例，抑制其轉(zhuǎn)錄因子Eomes的表達(dá)，并破壞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes之間的轉(zhuǎn)錄平衡，進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞的功能。本文結(jié)果顯示，在健康人群中地塞米松72小時干預(yù)對Th1細(xì)胞比例、功能性細(xì)胞因子的分泌乃至轉(zhuǎn)錄水平的影響，為探討地塞米松的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。