(1.南華大學(xué)，湖南 衡陽 421001；2.湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)來自于哺乳動物囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)并且具有在體外無限復(fù)制、自我更新和向各譜系細(xì)胞分化的潛能[1]。PHC1蛋白(也稱rae28)是哺乳動物和果蠅多梳家族蛋白(Polycomb Group protein，PcG)PRC1復(fù)合物的重要一員，蛋白結(jié)構(gòu)本身含有SAM(sterile alpha motif)結(jié)構(gòu)域和鋅指(zinc finger)結(jié)構(gòu)，其中SAM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)PHC1與其它蛋白的相互作用使其發(fā)生寡聚化，而鋅指結(jié)構(gòu)域能夠和核酸結(jié)合，兩者對于cPRC1介導(dǎo)的基因沉默都發(fā)揮重要作用[2-3]。

有研究表明，胚胎干細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育和體外分化伴隨著由表觀遺傳學(xué)機(jī)制介導(dǎo)的mESCs多能干性基因的逐漸關(guān)閉以及分化相關(guān)基因逐漸開啟過程[1，4]。故PHC1可不完全通過cPRC1介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制介導(dǎo)靶基因的沉默參與多能干性的維持[5]。因此，本研究擬通過慢病毒介導(dǎo)沉默mESCs中PHC1基因的表達(dá)，初步探討沉默PHC1基因后對mESCs的多能干性的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Empty vector 為PLKO克隆載體，購自addgene；shRNA PHC1質(zhì)粒、PGL-3nanog 4.8 reporter、PHC1、nanog、sox2、oct4質(zhì)粒均前期構(gòu)建完成，保存于-80 ℃冰箱；胎牛血清FBS購自Gibco，高糖購自Corning，0.1% geltin明膠、PHC1、nanog、oct4、sox2抗體均購自abcam；actin抗體、RIPA裂解液購自碧云天；轉(zhuǎn)染試劑盒購自百恩維生物，Lipo2000購自sigma；shRNA序列合成及測序為擎科生物；ECL顯色液購自Thermo；Brilliant SYBR Green qRT-PCR Master Mix購自Takara；Luciferase Assay Kit 購自sigma。

1.2 PHC1-shRNA細(xì)胞系構(gòu)建

將shRNA PHC1和PLKO空載質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒PSPAX，PMD共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收病毒，濃縮、離心并感染mESC細(xì)胞，感染mESCs 后24 h添加polybrene加強(qiáng)感染效率，48 h后加puro篩選3～5天得到穩(wěn)定的PHC1敲降mESC細(xì)胞系，并進(jìn)行后續(xù)實驗。本實驗RNA干擾設(shè)計圖見圖1。shRNA:5′-CCGGCACCTGAACCAACCTCTAAACCTC GAGGTTTAGAGGTTGGTTCAGGTGTTTTTG-3′。

圖1 RNA干擾設(shè)計圖

1.3 Western blot檢測PHC1蛋白表達(dá)

待測mESCs棄培養(yǎng)基，PBS清洗待測細(xì)胞3遍，置于冰上，加入RIPA和蛋白酶抑制劑使細(xì)胞裂解，吹打裂解細(xì)胞并收集至2 mL EP管中，超聲破碎后離心收集蛋白，BCA法蛋白定量，10%濃度的SDS-PAGE凝膠分離蛋白，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，按100 V恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜時間約120 min，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，剪膜，加入待測一抗，4 ℃搖床過夜孵育，PBST洗膜3次，10 min/次，二抗室溫孵育1 h，洗膜同前。ECL顯影曝光條帶并分析結(jié)果。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

37 ℃水浴鍋內(nèi)復(fù)蘇mESCs，隨后加入適量完全培養(yǎng)基離心、重懸并輕輕吹打，轉(zhuǎn)移至提前0.1% geltin明膠包被培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。mESCs培養(yǎng)基濃度與成份配比，50 mL為例：FBS 7.5mL、Glutamax 500 μL、P/S 500 μL、NEAA 500 μL、β-巰基乙醇 3.5 μL、LIF 5 μL、高糖H-DMEM補足50 mL。293T細(xì)胞培養(yǎng)基濃度和成份配比，50 mL為例：FBS 5 mL、Glutamax 500 μL、P/S 500 μL、NEAA 500 μL、高糖H-DMEM補足50 mL。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關(guān)基因表達(dá)

待測細(xì)胞均采用Trizol提取RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ，然后根據(jù)Brilliant SYBR Green qRT-PCR Master Mix試劑說明書程序進(jìn)行qRT-PCR測定基因表達(dá)。qRT-PCR 10 μL反應(yīng)體系：cDNA 0.3 μL、SYBR 5 μL、F 0.2 μL、R 0.2 μL、ddH2O 4.3 μL。本文中所用的qRT-PCR引物如下：PHC1:F:5′-GAGTCAGACAGAGCACCAGC-3′，R:5′-CTGCACTGCTTGTCGTTCAT-3′;Actin:F:5′-GTGTGACGACGAGGAGAC-3′，R:5′-CGATGGACGGGAAGACAG-3′;nanog:F:5′-TGAGCTATAAGCAGGTTAAGAC-3′，R:5′-CAATGGATGCTGGGATACTC-3′;oct4:F:5′-CACGAGTGGAAAGCAACTCAG-3′,R:5′-CTGGGAAAGGTGTCCCTATAG-3′;sox2:F:5′-CGAGATAAACATGGCAATCAAATG-3′,R:5′-AACG TTTGCCTTAAACAAGACCAC-3。

1.6 免疫熒光染色

PHC1、nanog、sox2、oct4、DAPI免疫熒光染色，具體步驟為：棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，4%的多聚甲醛固定樣本，避光15 min，PBS漂洗3遍，加入封閉液0.5 mL/孔，封閉30 min后棄去，4 ℃避光過夜孵育一抗，次日PBST漂洗3次，5 min/次，孵育二抗，室溫避光約2 h后吸走二抗，PBST洗3次，5 min/次，DAPI核染12孔板，0.5 mL/孔，10 min后吸走再用PBST洗3遍，5 min/次封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照并保存。

1.7 熒光素酶報告基因技術(shù)(Luciferase Reporter)

提前一天24孔板準(zhǔn)備dox誘導(dǎo)的nanog過表達(dá)細(xì)胞系，待細(xì)胞密度生長到65%～75% 時，采用Lipo2000共轉(zhuǎn)PGL-3 nanog 4.8 kb reporter (或PGL-3空載質(zhì)粒)、TOMATO-PHC1(或TOMATO空載質(zhì)粒)、Renilla質(zhì)粒(內(nèi)參質(zhì)粒)、sox2、oct4等相關(guān)質(zhì)粒，每組實驗設(shè)置3個副孔，轉(zhuǎn)染12 h后，PBS潤洗細(xì)胞3次，隨后加入40 μL Passive Lysis Buffer，于不透光的96孔板中加入100 μL的Luciferase Assay Buffer II,再加入20 μL的細(xì)胞裂解液，混勻,檢測firefly luciferase activity，得A值；另加入100 μL Stop & Glo Reagent，混勻，檢測Renilla luciferase activity，得B值(兩次檢測均使用同一臺酶標(biāo)儀)，計算A/B值，作圖。PGL-3 nanog 4.8 kb reporter 示意圖如圖2。

圖2 PGL-3 nanog 4.8kb Luciferase Reporter示意圖

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒介導(dǎo)的PHC1敲降細(xì)胞系鑒定

mESCs經(jīng)慢病毒介導(dǎo)感染shRNA后，電子顯微鏡下觀察mESCs細(xì)胞形態(tài)，對照組mESCs呈圓形，核大質(zhì)少，邊界清楚(control和Empty vector組)，而實驗組(shPHC1組)mESCs邊緣變的銳利，形態(tài)變的不規(guī)則，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象(圖3)，qRT-PCR 、Western blot灰度掃描結(jié)果均顯示PHC1在RNA和蛋白水平表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)(圖4)[6]，shRNA沉默PHC1蛋白效果理想。

圖3 慢病毒介導(dǎo)的PHC1敲降細(xì)胞系(400×)實驗組mESCs中沉默PHC1蛋白后，各組細(xì)胞形態(tài)；Scale Bar=100 μm

圖4 qRT-PCR及Western-Blot檢測PHC1表達(dá)A:qRT-PCR檢測PHC1的mRNA表達(dá)量；與control組比較，*P<0.05；與Empty vector組比較，#P<0.05；B:Western blot檢測PHC1蛋白；與control組比較，*P<0.05；與Empty vector組比較，#P<0.05

2.2 免疫熒光染色分析

PHC1與nanog、sox2、oct4的免疫熒光染色分析示PHC1基因敲降的mESCs，nanog、sox2、oct4蛋白的表達(dá)同時下調(diào)，且與PHC1具有下調(diào)共定位現(xiàn)象(圖5A白色箭頭所指)，對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，nanog下調(diào)最為顯著(nanog約60%，sox2約32%,oct4約26%)(圖5B)。同時qRT-PCR檢測多能干性基因nanog、sox2、oct4表達(dá)，與control、Empty vector相比，均出現(xiàn)明顯下調(diào)，且nanog下調(diào)最顯著(圖6)。

2.3 PHC1與nanog的Luciferase Reporter分析

Luciferase Reporter結(jié)果證明nanog、sox2、oct4三者共存時，其luciferase熒光值最高，nanog單獨存在時次之，sox2、oct4二者存在時較低(圖7A)；而當(dāng)PHC1與nanog共存時，其luciferase熒光值強(qiáng)于nanog自身，低于nanog、sox2、oct4共存時，PHC1單獨存在時，PHC1并未激活PGL-3 nanog 4.8 kb reporter的熒光值(圖7B)。

圖5 PHC1、nanog、sox2、oct4免疫熒光染色A:免疫熒光染色，白色箭頭示PHC1敲降的細(xì)胞同時下調(diào)nanog、sox2、oct4的表達(dá)。Scale Bar為20 μm，100×B:PHC1與nanog、sox2、oct4下調(diào)共定位結(jié)果與nanog組比較，*P<0.05；與sox2組比較，#P<0.05

圖6 qRT-PCR檢測多能干性基因與control組比較，*P<0.05；與Empty vector組比較，#P<0.05

圖7 PHC1與nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測A：nanog、sox2、oct4的轉(zhuǎn)錄活性檢測與小組b比較，*P<0.05；與小組c比較，#P<0.05；B:PHC1、nanog的轉(zhuǎn)錄活性檢測與小組b比較，*P<0.05； +表示轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒

3 討 論

在以往的研究已經(jīng)表明PcG都能作用于大量的調(diào)節(jié)細(xì)胞命運相關(guān)的基因，激活基因轉(zhuǎn)錄，這些基因的活化會促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)[1，7-8]。另外，PcG的結(jié)合部位富集有編碼一些信號傳導(dǎo)通路的基因TGF、BMP、Wnt和FGF，這些通路在分化譜系過程以及各組織干細(xì)胞中具有重要作用[4]，也有研究證實沉默RING1A/B能夠引起mESCs的分化[9]，基于以上研究，本實驗設(shè)計了在mESCs中沉默PHC1蛋白，并探討其與多能干性基因nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

本實驗顯示，敲降PHC1基因后，mESCs呈現(xiàn)分化狀態(tài)，初步證明PHC1基因在維持mESCs多能干性方面具有重要作用。同時nanog、sox2、oct4的RNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，并存在下調(diào)共定位現(xiàn)象，且nanog的下調(diào)最顯著。推測敲降PHC1蛋白后可能是通過參與影響nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)一步影響nanog、oct4、sox2的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控，前期有研究證實，在mESCs中，細(xì)胞的多能干性很大程度上是由nanog、sox2、oct4(“鐵三角”)調(diào)控[10-12]，既能相互調(diào)控，同時也能調(diào)控其自身表達(dá)[13]，其中oct4和sox2能形成異源二聚體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，且這三種轉(zhuǎn)錄因子共同結(jié)合到基因的啟動子區(qū)，激活調(diào)控維持ESC多能干性狀態(tài)基因的表達(dá)[14]，抑制胚層相關(guān)基因的表達(dá)；于是進(jìn)一步完善nanog Luciferase Reporter實驗，提示PHC1與nanog之間可能會形成某種復(fù)合物參與nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果證實，敲降PHC1蛋白后可能是因為影響了nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而參與了核心轉(zhuǎn)錄因子nanog、sox2、oct4之間的相互轉(zhuǎn)錄機(jī)制，而細(xì)胞內(nèi)nanog、oct4與sox2蛋白量的微小變化改變了轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的比例，從而影響它們對互作蛋白選擇的偏好性，改變了細(xì)胞內(nèi)基因整體的表達(dá)譜，使胚胎干細(xì)胞出現(xiàn)分化，參與mESCs多能干性維持。

綜上所述，本實驗結(jié)果初步表明，敲降PHC1基因后可能是通過影響nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而參與了核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控“鐵三角”(nanog、oct4、sox2)之間的相互轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致mESCs的分化，參與mESCs多能干性的維持。