(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所;湖南省特殊病原體防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，血吸蟲感染后引起的免疫病理損傷除了特異性免疫應(yīng)答參與外，固有免疫系統(tǒng)也參與其中，而TLR途徑是固有免疫應(yīng)答不可或缺的成員[1]。Toll樣受體(toll like receptor，TLR)是一類模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，它與病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)結(jié)合，激活TLR信號(hào)通路活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，分泌IL-1β，TNF-α和IL-6等前炎癥細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)[2]。

研究表明TLR4可能是可溶性糖蛋白的PRR，而這些糖蛋白主要是由曼氏血吸蟲尾蚴和蟲卵分泌的，他們激活TLR信號(hào)通路，誘導(dǎo)眾多炎癥分子的分泌；有學(xué)者證明曼氏血吸蟲的脂類片段可被TLR2或TLR4識(shí)別，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子[3-5]。Pila及其同事[6]發(fā)現(xiàn)血吸蟲尾蚴及可溶性抗原分子可被TLR4識(shí)別，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的分泌。這些報(bào)道說明蟲源性分子引發(fā)固有免疫反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)可能與PRR激活NF-κB 信號(hào)途徑有關(guān)。為了探討日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(Schistosoma japonicum soluble egg antigen，SjSEA)和日本血吸蟲可溶性成蟲抗原(Schistosoma japonicum soluble adult worm antigen，SjSWA)是否能激活TLR 2、TLR 4信號(hào)通路，并作為其PAMP參與日本血吸蟲病免疫病理損傷。本研究通過構(gòu)建動(dòng)物模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)TLR信號(hào)通路相關(guān)分子及肝組織病理損傷指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和分析，為TLR途徑在日本血吸蟲病致病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與陽性釘螺 6～8周雌性Balb/c小鼠購自長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有公司，包含尾蚴的釘螺于江西省血吸蟲病防治研究所購買。

1.1.2 主要試劑 FITC anti-mouse CD28(TLR-2)，PE anti-mouse TLR-4，APC anti-mouse F4/80抗體均購于美國(guó)eBioscience公司；RNA提取試劑盒購于Invitrogen Trizol公司，Real-time PCR、SYBR Premix EX Taq試劑盒購于TaKaRa公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、 ELISA試劑盒購于上海萊茲生物科技有限公司；ALT和AST試劑盒購于浙江伊利康生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購于GIBCO公司；胎牛血清(FBS)購于杭州四季青生物工程公司。

1.1.3 主要儀器 FACS Calibur流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson公司；ABI 7900Real time PCR儀為ABI公司；NSA400全自動(dòng)生化分析儀為青島東軟公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 取6至8周齡雌性Balb/c小鼠25只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(5只)和感染組(20只)，感染組采用經(jīng)皮膚感染(18±2)條尾蚴，接觸十分鐘。分別于感染后14天、28天、42天及56天行麻醉處死小鼠，在無菌條件下眼球采血及摘取肝臟備用。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(pMφ)的制備 為了獲得更多的腹腔內(nèi)單核巨噬細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)前3天，用0.6～1 mL無菌石蠟油注射小鼠腹腔。麻醉處死小鼠，給小鼠腹腔注射20 mL PBS液，無菌抽取腹腔液，重復(fù)3次，收集腹腔液，1000 rpm離心10 min，棄上清，PBS重懸3～5次。用RPMI-1640培養(yǎng)基(含20% FBS及100 U/mL雙抗)重懸細(xì)胞，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，收集pMΦ待用。

1.2.3 SjSEA和SjSWA的制備 血吸蟲尾蚴感染新西蘭兔，45天剖殺，收集成蟲，取肝組織純化蟲卵。成蟲用生理鹽水在冰浴下勻漿，成蟲勻漿液和純蟲卵液在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎儀超聲破碎30 min(1500 Hz，每10 s間歇10 s，成蟲勻漿液超聲后需4 ℃冷浸48 h )，4 ℃下12 000 rpm離心30 min，取上清懸液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得無菌的SjSWA和SjSEA，測(cè)定蛋白含量后分裝，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SjSEA與SjSWA刺激小鼠pMΦ 將分離培養(yǎng)后的小鼠pMΦ接種于12孔板，每孔1 mL完全1640培養(yǎng)基，隨后分別加入SjSEA(10 mg/L)、SjSWA(10 mg/L)、LPS(10 mg/L)和PBS(10 mg/L)，每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育6 h、12 h、24 h。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)經(jīng)SjSEA和SjSWA刺激pMΦ后的TLR2和TLR4 mRNA水平 分別收集各孔細(xì)胞，按Trizol一步法提取總RNA。取RNA的總量為2 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH、TLR2和TLR4引物由Primer 軟件設(shè)計(jì)合成。GAPDH上游引物5′-TGGAGAAACCTG CCAAGTATGA-3′，下游引物5′-CTGTTGAAGTCGCAG GAGACAA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度440 bp；TLR2上游引物5′-ATGCTTCGTTG TTCCCTGTGTTGC-3′，下游引物5′-AACAAAGTGGTTGTCGCCTGCTTC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度261 bp；TLR4上游引物5′-AACCAGCTGTATTCCCTCAGCACT-3′，下游引物5′-ACTGCTTCTGTTCC TTGACCCACT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度253 bp。Real-time PCR條件：95℃ 5min；變性、退火、延伸各為95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)經(jīng)SjSEA和SjSWA刺激后pMΦ的IκB水平 在含有pMΦ的培養(yǎng)皿中加入相同濃度SjSEA和SjSWA，分別在0 min、15 min、30 min、60 min提取細(xì)胞層蛋白，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAG電泳，上樣量為20 μg， 然后用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白電泳條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，進(jìn)行Western blot分析。一抗為鼠抗IκB抗體(1∶1000稀釋)，4 ℃反應(yīng)過夜；TBST液洗膜5 min，重復(fù)3次，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(1∶1000稀釋)4 ℃反應(yīng)2 h。洗膜同上，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.7 血吸蟲感染小鼠肝組織HE染色觀察病理變化 取正常對(duì)照組及感染第2、4、6、8周組小鼠肝臟組織100 mg 于10%甲醛液中固定，石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.2.8 FCM檢測(cè)血吸蟲感染小鼠肝組織TLR2和TLR4水平 無菌取肝臟，用2mL staining buffer洗滌一次，在50目網(wǎng)上輕柔地研磨，使肝細(xì)胞通過尼龍網(wǎng)；加1mL混合酶(0.25% 胰蛋白酶，0.1% Collagense-TypeⅠ，0.1% Collagense-TypeⅣ，0.1% Hyaluronidase-TypeⅤ)消化15～25min；緩沖液洗1次，加2mL紅細(xì)胞裂解液裂解5min；離心，過濾；加入1 μL F4/80-APC抗體，0.5μL TLR4-PE抗體，0.5μL TLR2-FITC抗體，4℃避光孵育15min，2mL staining buffer重懸；離心，棄上清；加100μL Staining Buffer，輕彈混勻細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；以F4/80設(shè)門，計(jì)算TLR2和TLR4在總細(xì)胞上百分率。

1.2.9 血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平測(cè)定 按照各細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，將樣品光密度值帶人標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品細(xì)胞因子蛋白濃度(μg/L)。

1.2.10 感染小鼠血清中ALT、AST水平測(cè)定 按照說明書操作，應(yīng)用(東軟NSA400)上機(jī)檢測(cè)ALT和AST等生化指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SjSEA和SjSWA刺激pMΦ后TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平

SjSEA和SjSWA在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、6h、12h、24h)刺激pMΦ后，Real-time PCR分析 TLR4 的mRNA變化水平。結(jié)果表明與PBS組比較，LPS、SjSEA和SjSWA處理組中TLR4 mRNA表達(dá)顯著性升高，存在極顯著性差異，于12h達(dá)高峰，P<0.01，而TLR2 mRNA的表達(dá)水平在各處理組中無顯著性差異(圖1)。

圖1 SjSEA和SjSWA刺激pMΦ后TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平與PBS處理組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 SjSEA和SjSWA刺激pMΦ后IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)水平

pMΦ經(jīng)SjSEA、SjSWA、LPS和PBS處理0h、6h、12h和24h后，檢測(cè)前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)水平隨著可溶性抗原刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在12h細(xì)胞因子的分泌量最多，隨后降低，與PBS組比較各組細(xì)胞因子水平有極顯著性差異(P<0.05，圖2)。

2.3 SjSEA和SjSWA刺激對(duì)pMΦ IκB水平的影響

經(jīng)SjSEA和SjSWA處理pMΦ0min、15 min、30 min及60 min 后，結(jié)果顯示，pMΦ靜息時(shí)能檢測(cè)出明顯的IκB條帶， 而在處理30 min后IκB的表達(dá)下降，但是在處理60 min后有所回升(圖3)。

2.4 日本血吸蟲感染小鼠肝臟組織病理學(xué)變化

正常對(duì)照組(0w)小鼠肝臟內(nèi)未見蟲卵結(jié)節(jié)，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。小鼠在日本血吸蟲感染第4周后肝組織可見少量蟲卵， 輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)， 蟲卵肉芽腫少見；感染第6周有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及蟲卵肉芽腫形成；感染第8 周形成大量蟲卵肉芽腫，肝細(xì)胞有不同程度的變性、壞死，有大量膠原纖維聚集于蟲卵肉芽腫周圍(圖4)。

圖2 SjSEA、SjSWA刺激pMΦ后 IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平A：SjSEA、SjSWA刺激pMΦ后 IL-1β的表達(dá)水平；B：SjSEA、SjSWA刺激pMΦ后 IL-6的表達(dá)水平；C：SjSEA、SjSWA刺激pMΦ后TNF-α的表達(dá)水平

圖3 Western blot檢測(cè) pMΦ內(nèi)IκB蛋白降解情況A.SjSEA 刺激pMΦ后IκB的表達(dá);B.SjSWA刺激pMΦ后IκB的表達(dá)

圖4 日本血吸蟲感染小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果(100×)A：感染前；B：感染2周后；C：感染4周后；D：感染6周后；E：感染8周后

2.5 檢測(cè)血吸蟲感染小鼠肝組織TLR2和TLR4的表達(dá)水平

小鼠在血吸蟲感染2、4、6、8周時(shí)，取小鼠肝組織，F(xiàn)CM檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)TLR2和TLR4表達(dá)量。結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較感染小鼠肝組織內(nèi)TLR2和TLR4表達(dá)量顯著性升高(P<0.05，結(jié)果見圖5)。Real time-PCR分析小鼠肝組織內(nèi)TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)量，結(jié)果由圖6可見，血吸蟲感染小鼠肝臟組織中TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組比較顯著性升高(P<0.05，圖6)。

圖5 FCM檢測(cè)小鼠肝臟組織TLR2和TLR4表達(dá)量A：FCM檢測(cè)不同時(shí)期小鼠肝臟中TLR2的表達(dá);B：FCM檢測(cè)不同時(shí)期小鼠肝臟中TLR4的表達(dá)；C：小鼠肝臟組織TLR2和TLR4表達(dá)量 與未感染小鼠比較，*P<0.05

圖6 Real time-PCR檢測(cè)小鼠肝組織TLR2和TLR4 mRNA水平與未感染組比較，*P<0.05

2.6 ELISA檢測(cè)血吸蟲感染小鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平

取第1周至第八周的小鼠血清樣本，ELISA分析小鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未感染組比較小鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)水平顯著性升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，IL-1β在感染第4周分泌最多；TNF-α 在感染第3周分泌最多；IL-6 在感染第3周分泌最多(圖7)。

圖7 ELISA檢測(cè)血吸蟲感染小鼠血清中IL-1β，TNF-α和IL-6水平與未感染組比較，*P<0.05

2.8 日本血吸蟲感染小鼠血清中ALT和AST水平

為了檢測(cè)小鼠肝臟的損傷情況，本實(shí)驗(yàn)取小鼠不同時(shí)間點(diǎn)(2周、4周、6周和8周)的血清標(biāo)本，速率法檢測(cè)ALT和 AST表達(dá)水平。結(jié)果顯示與未感染照組比較感染小鼠在各感染時(shí)期ALT和 AST表達(dá)升高明顯(P<0.05，圖8)。

圖8 速率法檢測(cè)日本血吸蟲感染小鼠血清中ALT和AST水平與未感染組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.9 TLRs和CKs水平與肝損傷指標(biāo)ALT、AST的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：小鼠肝臟組織TLR2表達(dá)水平與血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫面積呈正相關(guān)，r值為0.973，P<0.05；在血吸蟲感染后IL-1β、IL-6與TLR2呈正相關(guān)，r值分別為0.968和0.950，P<0.05；肝損傷指標(biāo)ALT、AST與TLR2呈正相關(guān)，r值分別為0.903和0.807，P<0.05；小鼠肝臟組織TLR4表達(dá)水平與血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫面積呈正相關(guān)，r值為0.992，P<0.05；IL-1β、IL-6與TLR4呈正相關(guān)，r值分別為0.884和0.893，P<0.05；ALT、AST與TLR4呈正相關(guān)，r值分別為0.833和0.919(P<0.05，圖9)。

圖9 TLR2和TLR4與肝蟲卵肉芽腫面積、CKs及ALT、AST的相關(guān)性分析A：TLR2與ALT、AST的相關(guān)性分析;B：TLR2與IL-1、IL-6的相關(guān)性分析;C：TLR2/TLR4與肝蟲卵肉芽腫的相關(guān)性分析;D：TLR4與IL-1、IL-6的相關(guān)性分析;E：TLR4與 ALT 、AST的相關(guān)性分析

3 討 論

PAMP可通過TLR將其信號(hào)通路激活，參與固有免疫及啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗感染免疫。 血吸蟲感染宿主后，其分泌的可溶性抗原能否作為PAMP激活TLR途徑，參與血吸蟲感染的炎癥反應(yīng)和免疫病理損傷，是近年來研究的熱點(diǎn)。 為了探討 SjSEA和 SjSWA能否作為 PAMP激活 TLR途徑參與血吸蟲病炎癥反應(yīng)，本文通過分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和構(gòu)建日本血吸病動(dòng)物模型， 從體內(nèi)外研究 SjSEA和 SjSWA激活 TLR途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)情況，從而為固有免疫在日本血吸蟲病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為血吸蟲病的防治開辟了新道路。

體內(nèi)研究結(jié)果顯示：日本血吸蟲病模型小鼠肝組織中 TLR2和 TLR4表達(dá)明顯升高，尾蚴攻擊后6周快速上升，第8周達(dá)峰值，與肝臟病理變化呈顯著性正相關(guān)性(r<0.9)，與日本血吸蟲病病變程度相吻合。原因可能是尾蚴攻擊后6周，成蟲成熟，雌蟲大量產(chǎn)卵并沉積于肝組織，成蟲和蟲卵分泌的可溶性抗原，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞過量分泌TLR2及TLR4，進(jìn)而活化TLRs信號(hào)通路，IL-1β、TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)增加，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等聚集蟲卵周圍，導(dǎo)致肝蟲卵肉芽腫的形成。在感染后8周時(shí)，TLR2和TLR4表達(dá)量增高明顯，蟲卵肉芽腫達(dá)高峰。湯娟娟，等[7]研究發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR6表達(dá)水平在日本血吸蟲感染小鼠肝組織中顯著升高。

前炎性細(xì)胞因子及肝組織損傷指標(biāo)檢測(cè)表明TLR2及TLR4可能在血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫的形成中發(fā)揮重要作用。為了深入研究血吸蟲可溶性抗原是否可以作為TLR2及TLR4的PAMPs，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，本研究制備可溶性抗原(SjSEA和SjSWA)，體外誘導(dǎo)小鼠pMΦ，檢測(cè)TLR2/TLR4及IL-1β，TNF-α和IL-6的改變情況。結(jié)果顯示：經(jīng)可溶性抗原分子處理后pMΦ TLR4 mRNA顯著升高，而TLR2 mRNA水平無顯著性變化，說明可溶性抗原分子可能是TLR4的PAMPs；但是，感染小鼠肝組織中既有TLR2，也有TLR4的顯著升高，可能原因是血吸蟲的其他成份或分泌物與代謝產(chǎn)物作為TLR2的PAMPs，促進(jìn)TLR2信號(hào)途徑活化，引起肝組織的炎癥反應(yīng)。

TLRs的高表達(dá)有利于TLRs信號(hào)通路的活化，病原體及其成分與靶細(xì)胞膜上的TLRs結(jié)合后，招募相關(guān)蛋白，激活一系列激酶，最后激活NF-κB等核轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)IL-1β、TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)[8]。NF-κB和I-κB形成一個(gè)復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞外環(huán)境改變后，IκB磷酸化，活化后的IκB被降解，釋放NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[9]。因此，IκB蛋白降解可間接反應(yīng)NF-κB的活化[10]。檢測(cè)IκB的表達(dá)以反應(yīng)NF-κB的激活情況，結(jié)果顯示：SjSEA和SjSWA處理30 min后，IκB蛋白的表達(dá)下降明顯。證實(shí)可溶性抗原分子能誘導(dǎo)IκB降解，進(jìn)而活化NF-κB，誘導(dǎo)前炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了可溶性抗原分子能誘導(dǎo)pMΦ分泌前炎癥細(xì)胞因子，分泌水平在刺激12h達(dá)峰值。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SjSEA和SjSWA可以作為PAMPs使TLR4信號(hào)通路活化，誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)；日本血吸蟲感染后TLR2和TLR4表達(dá)水平顯著性升高，且與IL-1β、TNF-α與IL-6含量、肝蟲卵肉芽腫及ALT、AST含量呈正相關(guān)，說明可溶性抗原可能參與了肝蟲卵肉芽腫的發(fā)生與發(fā)展。該研究為TLRs分子在日本血吸蟲病中的致病作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)完善固有免疫在血吸蟲病中的致病作用具有重要意義。