黃 靜 張 璐 陳星華 楊英杰 李紫燃 程 暉

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：huang.jingkl@163.com)

糖尿病腎病是引起終末期腎衰竭的主要病因之一。腎小球臟層上皮細(xì)胞即足細(xì)胞，是腎小球濾過膜的最后一道屏障，其損傷對糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生與進(jìn)展的影響日益受到重視[1]。足突融合是足細(xì)胞損傷的特征性微觀病理改變，其與足細(xì)胞骨架重排密切相關(guān)[2]。在正常足突中，細(xì)胞骨架蛋白纖維狀肌動蛋白(fibrous actin,F-actin)有序地平行聚集成束，形成應(yīng)力纖維。病理狀態(tài)下，骨架發(fā)生重排，F(xiàn)-actin解聚或以松散的網(wǎng)狀機(jī)構(gòu)互相結(jié)合。骨架重排是足突融合的共同通路[2]，是糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。然而糖尿病腎病足細(xì)胞骨架重排的機(jī)制尚未明確。

IQ結(jié)構(gòu)域GTP酶活化蛋白1(IQ domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)是一個含有多個蛋白結(jié)合域的支架蛋白。Schwarz等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，IQGAP1蛋白在全身多個組織和細(xì)胞中表達(dá)，并在足細(xì)胞中大量表達(dá)。本課題組的前期研究顯示IQGAP1在嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架重排中發(fā)揮重要作用[4]。但I(xiàn)QGAP1是否參與糖尿病腎病的足細(xì)胞骨架重排尚未見報道。本課題旨在研究IQGAP1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架重排中的作用及其可能的機(jī)制，進(jìn)一步探討糖尿病腎病條件下足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清(美國Gibco公司，批號：1900-141)，1640培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WH01111810XP)，小鼠重組干擾素(美國PeproTech公司，批號：315-05)，細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013)，IQGAP1兔多克隆抗體(美國Santa Cruz公司，批號：sc-10792)，細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)兔多克隆抗體(美國Cell Signaling公司，批號：2462S)，β-肌動蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，批號：YSm-33036M)，鬼筆環(huán)肽(美國Sigma公司，批號：P5282)，X-tremeGENE轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司，批號：6366244001)，免疫沉淀試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P2012)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 永生化小鼠足細(xì)胞株由美國紐約Peter Mundel教授惠贈。常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，用含10%胎牛血清、10 U/mL小鼠重組干擾素的1640培養(yǎng)基，置于33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行增殖培養(yǎng)7～10 d，然后用含10%胎牛血清的無干擾素1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分化培養(yǎng)10～14 d后用于后續(xù)實驗。細(xì)胞分組：(1)將細(xì)胞分為6組，分別加入不同濃度葡萄糖(5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)刺激48 h，然后檢測各組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況；(2)另取細(xì)胞分為6組，加入高濃度葡萄糖(30 mmol/L)刺激不同時間(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)，然后檢測各組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況；(3)另取細(xì)胞分為6組，包括正常糖濃度組(5 mmol/L葡萄糖，NG組)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖，HG組)、高滲對照組(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇，HO組)、HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，每組均經(jīng)葡萄糖刺激48 h，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法詳見1.3，干預(yù)后檢測各組IQGAP1蛋白或Cdc42蛋白表達(dá)情況。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IQGAP1 IQGAP1全長表達(dá)載體(pCantag-myc-IQGAP1質(zhì)粒)由美國康奈爾大學(xué)Jon Erickson教授惠贈。取足細(xì)胞分別應(yīng)用5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，將正常糖濃度組及高糖組足細(xì)胞接種于6孔板中(25 cm2/孔)培養(yǎng)至足細(xì)胞融合50%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2 μg質(zhì)粒與6 μL轉(zhuǎn)染試劑混勻，加入200 μL無血清1640培養(yǎng)基中，30 min后加入培養(yǎng)細(xì)胞，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48～72 h?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法同上。

1.4 免疫印跡法檢測IQGAP1和Cdc42蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解液裂解NG組、NG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG組、HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，4℃ 2 500 r/min低溫離心5 min，后取上清，二喹啉甲酸BCA法測定蛋白濃度，100℃變性5 min，以20 μg/孔上樣，10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，一抗分別為IQGAP1兔多克隆抗體(1 ∶200)、Cdc42兔多克隆抗體(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，β-actin鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)作為內(nèi)參。相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。應(yīng)用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜，Gel-Pro Analyzer凝膠定量分析軟件分析蛋白條帶吸光度值。

1.5 F-actin染色 將NG組、HG組、HO組、HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別培養(yǎng)于多聚賴氨酸涂層的蓋玻片上，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，4%多聚甲醛室溫固定15 min，Triton X-100穿透，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-鬼筆環(huán)肽(5 μg/mL)4℃孵育過夜，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染核，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，抗熒光淬滅甘油封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)F-actin分布。采用F-actin外周環(huán)評分(cortical F-actin score,CFS)評價F-actin分布情況：(1)F-actin形成正常應(yīng)力纖維為0分；(2)F-actin外周環(huán)<1/2胞膜邊緣為1分；(3)F-actin外周環(huán)≥1/2胞膜邊緣為2分；(4)F-actin形成完整外周環(huán)為3分；每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，取平均值。

1.6 免疫共沉淀分析 取NG組、HG組、HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，按上海碧云天生物技術(shù)有限公司免疫沉淀標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行實驗。裂解細(xì)胞收集蛋白后，加入2 μg IQGAP1兔多克隆抗體，4℃過夜，加入20 μL充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動3 h，2 500 r/min離心5 min，收集沉淀，加入40 μL 1×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，取樣品用于SDS-PAGE電泳，以免疫沉淀條帶中Cdc42與IQGAP1灰度值的比值評估Cdc42和IQGAP1的結(jié)合情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖刺激對足細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)的影響 (1)高糖刺激48 h后的足細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)水平低于高糖刺激0 h后(P<0.05)，見圖1及表1。(2)應(yīng)用不同濃度葡萄糖刺激分化成熟的足細(xì)胞48 h，30 mmol/L葡萄糖刺激后足細(xì)胞的IQGAP1蛋白表達(dá)水平低于5 mmol/L葡萄糖刺激后的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖2及表2。(3)葡萄糖刺激48 h后，NG組與HO組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3及表3。

2.2 高糖刺激對足細(xì)胞F-actin骨架分布的影響 NG組及HO組足細(xì)胞的F-actin聚集成束，呈微絲樣結(jié)構(gòu)，延細(xì)胞長軸分布，形成應(yīng)力纖維。刺激48 h后，HG組足細(xì)胞的F-actin排列紊亂，F(xiàn)-actin形成核外周環(huán)。HG組的CFS高于NG組(P<0.05)，HO組與NG組的CFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4及表4。

圖1 高糖刺激不同時間后足細(xì)胞IQGAP1蛋白的表達(dá)

圖2 不同濃度葡萄糖刺激48 h后足細(xì)胞IQGAP1蛋白的表達(dá)

圖3 NG組、HG組、HO組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況

時間nIQGAP1相對表達(dá)水平0 h30.56±0.043 h30.55±0.026 h30.53±0.0212 h30.50±0.0124 h30.43±0.0248 h30.23±0.04? F值43.843P值<0.001

注：與0 h組比較，*P<0.05。

表2 不同濃度葡萄糖刺激48 h后足細(xì)胞IQGAP1蛋白的表達(dá)情況(x±s)

注：與5 mmol/L組比較，*P<0.05。

表3 NG組、HG組、HO組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05。

表4 NG組、HG組、HO組足細(xì)胞CFS比較(x±s，分)

注：與NG組比較，*P<0.05。

圖4 高糖刺激對足細(xì)胞F-actin骨架分布的影響(免疫熒光,×400)

2.3 IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對足細(xì)胞F-actin骨架分布的影響 FITC-鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，NG組足細(xì)胞的F-actin聚集成束，呈微絲樣結(jié)構(gòu)，沿細(xì)胞長軸分布，形成應(yīng)力纖維；HG組足細(xì)胞的F-actin排列紊亂，F(xiàn)-actin形成核外周環(huán)；HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的足細(xì)胞骨架重排部分逆轉(zhuǎn)。HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的CSF低于HG組(P<0.05)，而HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與HG組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5及表5。

圖5 IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對足細(xì)胞F-actin骨架分布的影響(免疫熒光，×400)

注：a為NG組；b為HG組；c為HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；d為HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

表5 4組轉(zhuǎn)染后足細(xì)胞的CSF比較(x±s，分)

注：與HG組比較，*P<0.05。

2.4 IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對足細(xì)胞IQGAP1及Cdc42蛋白表達(dá)的影響 (1)與NG組比較，NG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的IQGAP1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，而NG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的IQGAP1蛋白表達(dá)與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。HG組的IQGAP1蛋白表達(dá)水平低于NG組(P<0.05)，而HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的IQGAP1蛋白表達(dá)水平高于HG組(P<0.05)。見圖6及表6。(2)HG組的Cdc42蛋白表達(dá)水平低于NG組(P<0.05)，而HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的Cdc42蛋白表達(dá)水平高于HG組(P<0.05)，HG組與HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6及表7。

圖6 IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后足細(xì)胞IQGAP1和Cdc42蛋白的表達(dá)情況

注：1、2、3、4、5、6分別為NG組、NG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG組、HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

表6 6組足細(xì)胞IQGAP1蛋白的表達(dá)情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

表7 6組足細(xì)胞Cdc42蛋白的表達(dá)情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

2.5 IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對IQGAP1和Cdc42相互作用的影響 與NG組比較，HG組的IQGAP1與Cdc42結(jié)合減少(P<0.05)；與HG組比較，HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的IQGAP1與Cdc42結(jié)合增加(P<0.05)；而HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與HG組的IQGAP1與Cdc42的結(jié)合情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7及表8。

圖7 IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后IQGAP1和Cdc42的結(jié)合情況

注：1、2、3、4分別為NG組、HG組、HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HG+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

表8 4組足細(xì)胞中IQGAP1與Cdc42的結(jié)合情況(x±s)

注：與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

3 討 論

足細(xì)胞病是一種由多種因素引起，以足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和(或)功能損傷為主要特點的腎小球疾病[5]，主要表現(xiàn)為足突融合、凋亡或去分化增殖。足突融合是足細(xì)胞損傷的特征性微觀病理改變，見于多種腎小球疾病，如微小病變型腎病、糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等[6]。足突融合與足細(xì)胞骨架重排密切相關(guān)，其中足細(xì)胞骨架重排是足突融合的共同通路[2]。然而糖尿病腎病足細(xì)胞骨架重排的機(jī)制尚不明確。

IQGAP是一種含有多個蛋白結(jié)合域的支架蛋白家族，因含有類似RasGTPs催化域系列和4個可與鈣調(diào)蛋白相互作用的IQ基序而得名。IQGAP1是其中最重要且分布最廣泛的成員，含有肌動蛋白結(jié)合區(qū)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶Ⅱ蛋白結(jié)合區(qū)、Rho鳥苷三磷酸酶(Rho-guanosine triphosphatase，Rho GTPase)結(jié)合區(qū)及鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[7]。既往研究表明IQGAP1在細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排來調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移和極化[8-11]。本課題組的前期研究結(jié)果表明IQGAP1參與嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架重排[4]。但關(guān)于IQGAP1在糖尿病腎病領(lǐng)域的研究卻很少。本研究結(jié)果顯示，HG組足細(xì)胞的F-actin排列紊亂，F(xiàn)-actin形成核外周環(huán)，且其CFS高于NG組(P<0.05)，而HO組與NG組的CFS無差異(P>0.05)，這提示高糖刺激可引起足細(xì)胞骨架重排；高糖(30 mmol/L)刺激后足細(xì)胞的IQGAP1蛋白表達(dá)水平低于正常濃度(5 mmol/L)葡萄糖刺激后的水平(P<0.05)，且高糖刺激48 h后的足細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)水平低于高糖刺激0 h后的水平(P<0.05)，提示高糖刺激可下調(diào)足細(xì)胞的IQGAP1蛋白表達(dá)，并在一定程度上呈時間及濃度依賴。此外，HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的IQGAP1蛋白表達(dá)水平高于HG組(P<0.05)，提示IQGAP1轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)高糖刺激引起的IQGAP1表達(dá)減少；HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的足細(xì)胞骨架重排部分逆轉(zhuǎn)，且其CSF低于HG組(P<0.05)，提示上調(diào)足細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架重排改善。以上結(jié)果說明IQGAP1蛋白可能參與糖尿病環(huán)境中的足細(xì)胞骨架重排，我們推測支架蛋白IQGAP1可能通過與某一蛋白結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

既往有學(xué)者認(rèn)為，IQGAP1對細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)與Rho GTPase有關(guān)，IQGAP1含有可與Rho GTPase家族結(jié)合的區(qū)域，可通過與Rho GTPase結(jié)合調(diào)節(jié)骨架重排[8-10，12]。Rho GTPase在肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，目前研究得最多的成員是Cdc42、Rac1、Rho[13]。Cdc42通過誘導(dǎo)肌動蛋白聚合，在足細(xì)胞骨架重排中發(fā)揮重要作用，研究證實敲除足細(xì)胞中Cdc42的編碼基因，可抑制肌動蛋白向腎小球足細(xì)胞特異性蛋白—nephrin聚集位點集聚，從而導(dǎo)致先天性腎病綜合征的發(fā)生[14]。有學(xué)者對淋巴細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，IQGAP1、Cdc42、肌鈣蛋白可結(jié)合形成三聯(lián)體，發(fā)生免疫共沉淀[15-16]。本研究結(jié)果顯示，HG組的Cdc42蛋白表達(dá)水平低于NG組(P<0.05)，提示高糖刺激不僅可誘導(dǎo)足細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)減少和足細(xì)胞骨架重排，還可下調(diào)Cdc42表達(dá)。本研究中的免疫共沉淀結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組的IQGAP1與Cdc42結(jié)合減少(P<0.05)，與HG組比較，HG+IQGAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的IQGAP1與Cdc42結(jié)合增加(P<0.05)，提示在高糖條件下小鼠足細(xì)胞IQGAP1與Cdc42結(jié)合減少，而通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染增強IQGAP1的表達(dá)后，可增加二者的結(jié)合，從而改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架重排。

綜上所述，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架重排，并減少IQGAP1及Cdc42蛋白表達(dá)以及IQGAP1與Cdc42的結(jié)合，而IQGAP1可能通過與Cdc42結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排。IQGAP1/Cdc42結(jié)合途徑可為糖尿病腎病的防治提供一個新的治療靶點。