邵鉞馨，曲赫選，鐘玉玲，黃江濤，李雄龍，史懷平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100）

近年來(lái)，隨著人們對(duì)乳制品的認(rèn)可，促使乳制品行業(yè)快速發(fā)展，對(duì)乳的營(yíng)養(yǎng)研究不斷深入。張志強(qiáng)等[1]研究表明，牛奶乳清蛋白占牛奶中蛋白質(zhì)的20%；乳清中的鈣含量占牛奶總鈣的38%，磷含量占牛奶總磷的50%。在乳制品生產(chǎn)中，高質(zhì)量的乳清粉可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑用于生產(chǎn)嬰兒配方奶粉，同時(shí)乳清粉也被應(yīng)用于羔羊犢牛代乳料、仔豬飼料的生產(chǎn)等，需求量呈逐年增加趨勢(shì)。2017年我國(guó)乳清進(jìn)口量達(dá)49.7萬(wàn)t[2]，與2007年相比增長(zhǎng)近兩倍，其中很大一部分用于飼料生產(chǎn)。隨著乳清產(chǎn)品在市場(chǎng)上的廣泛利用，乳清蛋白的提取效果越發(fā)受到關(guān)注。乳清蛋白有多種提純方法，常見(jiàn)方法有乙醇分級(jí)沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、離心法、膜過(guò)濾法、CO2沉淀分離法，此外還有超臨界CO2萃取法、雙水相萃取法等，但以上方法提純過(guò)程單一，對(duì)乳清蛋白的分離效果不甚理想。本研究根據(jù)羊奶蛋白的特性，對(duì)比分析了多種分離方法的處理效果，以期獲得最佳乳清蛋白分離方法，提高乳清蛋白得率。

1 材料與方法

1.1 材料

羊奶采自西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能羊原種場(chǎng)。選擇6只同質(zhì)性良好的西農(nóng)薩能奶山羊，在母羊產(chǎn)羔后第35天采集奶樣進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 單一方法分離乳清

1.2.1.1 乙醇分級(jí)沉淀法

將一定體積的羊乳加入離心管中，添加占總體積20%的無(wú)水乙醇，攪拌均勻后放置1h過(guò)濾，去除沉淀物，保留上清液；然后在上清液中添加無(wú)水乙醇，使乙醇體積比例至35%，攪拌均勻；繼續(xù)添加無(wú)水乙醇直至乙醇體積比值至55%，攪拌均勻。放置1h后4 000r/min離心，收集沉淀物分析。

1.2.1.2 等電點(diǎn)沉淀法

羊乳在3 000g、2℃條件下離心15min，棄去上層脂肪，制得脫脂乳；用1mol/L鹽酸調(diào)脫脂羊乳pH至4.6，然后在5 000g、2℃條件下離心20min，收集上清液分析。

1.2.1.3 離心法

羊奶在17 800g、2℃條件下離心30min，然后棄去上層脂肪后收集上清液分析。

1.2.1.4 多種方法復(fù)合分離乳清

將上述3種分離方法經(jīng)不同方式復(fù)合使用分離羊乳清，主要包括：①等電點(diǎn)法+乙醇法+離心法；②等電點(diǎn)法+離心法+乙醇法；③離心法+乙醇法+等電點(diǎn)法；④等電點(diǎn)法+乙醇法；⑤離心法+乙醇法；⑥離心法+等電點(diǎn)法；⑦離心法+等電點(diǎn)法+乙醇法；⑧乙醇法+等電點(diǎn)法；⑨乙醇法+離心法；⑩等電點(diǎn)法+離心法；乙醇法+等電點(diǎn)法+離心法； 乙醇法+離心法+等電點(diǎn)法。然后，對(duì)收集到的乳清進(jìn)行分析，檢驗(yàn)分離效果。

1.2.2 乳清純度檢測(cè)

1.2.2.1 羊奶乳清中總蛋白含量測(cè)定

提取羊奶乳清后，使用 BCA 蛋白濃度測(cè)量試劑盒（碧云天，P0012），以 0.9% NaCl 為空白，1.0mg/mL牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，分析羊奶乳清中總蛋白含量。之后，將分離得到的乳清總蛋白保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳

將提取的乳清蛋白與樣品緩沖液混合后，沸水加熱5min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳程序設(shè)置為100V、30min，之后轉(zhuǎn)為140V、90min。電泳結(jié)束后對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G-250染色，之后脫色至背景透明，分析所得乳清蛋白的主要蛋白組分。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 5.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，最終試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清中總蛋白分離效果比較

酪蛋白和乳清蛋白構(gòu)成乳蛋白[3]。通過(guò)不同分離方法對(duì)羊奶乳蛋白進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇法、等電點(diǎn)法、離心法對(duì)羊奶乳清中總蛋白分離的效果有顯著差異，其中離心法的效果最好，總蛋白濃度是15.706mg/mL，乳清中總蛋白得率是68.40%。上述三種方法不同方式配合使用后，發(fā)現(xiàn)“離心+等電點(diǎn)”配合使用總體效果較好，總蛋白濃度是10.226mg/mL，乳清中總蛋白得率是44.5%（見(jiàn)表1）。采用乙醇法分離的乳清中總蛋白得率明顯偏低，與離心法或等電點(diǎn)法復(fù)合法相比分離得到乳清總蛋白濃度偏低，分離效果相對(duì)差。

表1 不同方法提取乳清的結(jié)果比較

2.2 乳清蛋白中的蛋白組分檢測(cè)

奶樣經(jīng)SDS-PAGE電泳并通過(guò)imagej軟件分析發(fā)現(xiàn)，乳清中α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白含量相對(duì)較高，但在不同分離法中差異明顯。采用等電點(diǎn)、離心、離心+等電點(diǎn)、等電點(diǎn)+離心、離心+乙醇+等電點(diǎn)等分離法，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白條帶明顯，說(shuō)明所獲得的乳清中這兩類(lèi)蛋白組分含量高；但是，采用乙醇法、等電點(diǎn)+乙醇法、離心+乙醇法、離心+等電點(diǎn)+乙醇法、乙醇+等電點(diǎn)法、乙醇+離心法、乙醇+等電點(diǎn)+離心法、乙醇+離心+等電點(diǎn)法、等電點(diǎn)+乙醇+離心法、等電點(diǎn)+離心+乙醇法、等電點(diǎn)+離心+乙醇法等分離法，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白條帶微弱，說(shuō)明所獲得的乳清中這兩類(lèi)蛋白組分含量少（圖1）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，山羊乳清中α-乳清蛋白含量低于β-乳球蛋白（圖2）。

圖1 SDS-PAGE電泳圖

圖2 不同乳清分離方法的β-乳球蛋白和α-乳清蛋白imagej灰度值

2.3 乳清中酪蛋白去除率檢測(cè)

表2 不同分離方法的酪蛋白去除率

由表2可知，不同乳清蛋白分離方法所去除的酪蛋白含量差異顯著。采用等電點(diǎn)法的酪蛋白去除率為48.5%，采用離心法酪蛋白去除率為25.9%，采用“離心法+等電點(diǎn)法”酪蛋白去除率為63.9%，采用“等電點(diǎn)法+離心法”酪蛋白去除率為48.4%，采用“離心+乙醇+等電點(diǎn)法”酪蛋白去除率為89.8%，可見(jiàn)，“離心法+等電點(diǎn)法”、“離心+乙醇+等電點(diǎn)法”獲得的乳清純度較好。

2.4 乳清中αs1-酪蛋白殘留量檢測(cè)

酪蛋白為乳蛋白的重要成分，占總蛋白含量的80%左右，其成分主要包括κ-酪蛋白、αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白和β-酪蛋白[3]。由于αs1-酪蛋白為過(guò)敏源，在接下來(lái)的試驗(yàn)中分析其在純化乳清蛋白過(guò)程中的去除率。根據(jù)αs1-酪蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖4），然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中αs1-酪蛋白的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用等電點(diǎn)法、離心法、“離心法+等電點(diǎn)法”、“等電點(diǎn)法+離心法”所獲得的乳清中αs1-酪蛋白濃度分別為2.233mg/mL、2.233mg/mL、2.285mg/mL、2.460mg/mL，去除率分別達(dá)到16.90%、16.90%、14.90%、8.40%（表3）。從中可見(jiàn)，“等電點(diǎn)法+離心法”去除αs1-酪蛋白效果差。

圖4 αs1-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)

表3 四種分離方法處理后的αs1-酪蛋白濃度

3 討論

3.1 不同分離方法對(duì)乳清中總蛋白含量的影響

乙醇分級(jí)沉淀法在分離乳清蛋白時(shí)，蛋白共沉多且有局部變性，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)；等電點(diǎn)沉淀法雖然準(zhǔn)確到位，但操作較復(fù)雜，pH值也不容易精確測(cè)定；離心法可定性或定量分析，但對(duì)試驗(yàn)儀器要求較高。這些方法雖然都可以將乳清蛋白分離，但是提純過(guò)程都有不足。本試驗(yàn)中乙醇法分離乳清中總蛋白濃度偏低，邊艷杰等[4]研究表明，加入乙醇裂解液抽提牛奶乳清中總蛋白，得到的總蛋白濃度為5.01mg/mL，分析其值低的原因，可能為部分蛋白加入乙醇等裂解液變形失活。本試驗(yàn)中，“離心法+等電點(diǎn)法”是將羊奶樣品經(jīng)均質(zhì)處理后，用鹽酸調(diào)節(jié)羊奶上清液的pH至4.6～4.7，然后進(jìn)行靜置，直至不再析出沉淀，于18～25℃條件下離心，離心的轉(zhuǎn)速為≥17 000g，離心的時(shí)間≥0.5h，離心后棄去離心體系的上層脂肪和下層沉淀，吸取得到的清液為羊奶乳清總蛋白樣品，用等電點(diǎn)沉淀法分離羊奶上清液中的酪蛋白，收集分離酪蛋白后的羊奶上清液，得到羊奶乳清蛋白。本試驗(yàn)中離心法得到的總蛋白濃度為（15.706±0.101）mg/mL，“離心+等電點(diǎn)”得到的總蛋白濃度為（10.226±0.240）mg/mL，“等電點(diǎn)+離心”得到的總蛋白濃度為（12.438±0.081）mg/mL，與陳靜廷等[5]的研究結(jié)果相似，該研究在提取乳清蛋白時(shí)，調(diào)節(jié)牛奶乳清pH值為4.6，等電點(diǎn)沉淀提取法蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為（11.36±1.1）mg/mL。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于乳清蛋白分離方法的研究較少，尚未建立乳清蛋白提純方法，現(xiàn)有研究多采用等電點(diǎn)沉淀分離乳清蛋白，復(fù)合法研究報(bào)道較少。

3.2 不同分離方法對(duì)乳清蛋白組分的影響

乳清蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、血清白蛋白等，還存在少量的乳鐵蛋白、生長(zhǎng)因子和乳過(guò)氧化物酶等成分[6,7]。乳清蛋白可以經(jīng)過(guò)高溫、磷酸化、酶水解等方法加工[8]，能夠提高其乳化性，應(yīng)用到食品、飼料等不同領(lǐng)域。王潔雯等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白成分中α-乳清蛋白基本以單拷貝形式整合到宿主基因組中，是乳汁中酸性鈣結(jié)合蛋白，且穩(wěn)定遺傳。楊懷榮等[10]利用高效液相色譜儀測(cè)定豬乳中乳清蛋白含量發(fā)現(xiàn)，α-乳清蛋白在分娩后含量逐漸上升，而β-乳球蛋白在第16天含量最低，為5.6mg/mL。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同分離乳清蛋白方法的探究發(fā)現(xiàn)，分離過(guò)程中會(huì)造成乳清蛋白成分的損失。張清勇等[11]研究表明，在當(dāng)歸中提取多糖時(shí)，乙醇能夠改變當(dāng)歸多糖中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率。有研究表明，20%乙醇可沉淀球蛋白，40%乙醇可沉淀白蛋白。由本試驗(yàn)結(jié)果可看出，乙醇法對(duì)α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的含量影響最大。復(fù)合法中含乙醇法時(shí)分離效果均不理想。離心法較等電點(diǎn)法的乳清蛋白得率少，但兩種方法復(fù)合使用時(shí)，β-乳球蛋白的得率高于50%。上述研究結(jié)果表明，為提高乳清生產(chǎn)價(jià)值，降低經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)避免使用“乙醇法”，高效利用“離心法”或“等電點(diǎn)法”。

3.3 分離方法對(duì)酪蛋白殘留量的影響

有研究表明，山羊奶中酪蛋白含量與牛奶中酪蛋白含量相似[12]；山羊奶中的αs1-酪蛋白含量比牛奶中低38.57%；山羊奶中的κ-酪蛋白和β-酪蛋白含量比牛奶中的κ-酪蛋白和β-酪蛋白含量高24.60%[13]。不同單體蛋白含量導(dǎo)致酪蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜不一[14]，造成分離羊奶乳清蛋白時(shí)酪蛋白的殘余量不同。趙琦[15]研究表明，酪蛋白是以多種蛋白膠束方式存在，各種酪蛋白的穩(wěn)定性、敏感性不同，造成了在分離乳清蛋白過(guò)程中酪蛋白殘留的差異。張光馳[16]研究表明，酪蛋白膠束中磷酸鈣的存在，增強(qiáng)了酪蛋白穩(wěn)定性，當(dāng)pH值低于6.8時(shí)，膠體磷酸鈣開(kāi)始溶解，pH值低于4.6時(shí)，酪蛋白沉淀溶解。朱玉英等[17]研究表明，采用等電點(diǎn)沉淀法，嶗山奶山羊乳中酪蛋白的乳化穩(wěn)定性較好，這可能與酪蛋白的pH值有關(guān)。在分離乳清過(guò)程中，乳球蛋白與酪蛋白之間發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生酪蛋白聚沉物[18]，影響酪蛋白殘余量。楊勇等[19]研究表明，采用pH值為4.6緩沖液預(yù)先脫脂牛奶，沉淀酪蛋白的量約為0.611mg/mL。本試驗(yàn)中“等電點(diǎn)法”沉淀脫脂羊奶中酪蛋白含量約為0.675mg/mL，“等電點(diǎn)+離心法”沉淀脫脂羊奶中酪蛋白濃度為0.473mg/mL，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在分離乳清蛋白過(guò)程中，離心法比等電點(diǎn)法的酪蛋白殘余量多。

本試驗(yàn)中等電點(diǎn)法、離心法、“離心法+等電點(diǎn)法”、“等電點(diǎn)法+離心法”的αs1-酪蛋白去除率分別為16.90%、16.90%、14.90%、8.40%，αs1-酪蛋白的去除效果不顯著，不能達(dá)到理想羊奶脫敏效果。αs1-酪蛋白殘留量高的原因是，山羊乳中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白等的相對(duì)分子質(zhì)量都在20 000左右，為獲得更多乳清蛋白是很難有效去除αs1-酪蛋白的；同時(shí)，κ-酪蛋白的等電點(diǎn)為5.3～5.8，β-酪蛋白的等電點(diǎn)為4.83～5.07[20]，故本試驗(yàn)采用pH值為4.6的等電點(diǎn)沉淀法去除乳清中酪蛋白也不能達(dá)到理想效果，因此αs1-酪蛋白殘留量比較高。對(duì)此還需進(jìn)一步探索，尋找出更好的解決辦法。

4 結(jié)論

在多種羊奶乳清分離方法中，“離心法+等電點(diǎn)法”去除乳清中大量酪蛋白的同時(shí)，乳清蛋白得率高，明顯保留了α-乳清蛋白和β-乳球蛋白，并且αs1-酪蛋白去除率相對(duì)高，是一種有效分離羊奶乳清蛋白的科學(xué)方法。