薛艷蓉，王呈，梁茂文，弓耀忠，趙瑞生，田歌，劉波

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032；2.山西省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，太原 030012)

新疆地處我國邊疆，因其獨特的自然環(huán)境和地理環(huán)境成為我國重要的畜牧業(yè)基地。因為生活習(xí)慣和氣候的差異，各少數(shù)民族制作出很多獨特的食品，傳統(tǒng)酸奶就是少數(shù)民族民族群眾日常生活中不可或缺的一種食品，其生產(chǎn)方法簡單，完全靠自然發(fā)酵，風(fēng)味獨特。研究發(fā)現(xiàn)，新疆哈薩克牧民食用酸奶可能是預(yù)防食道癌的有效方法之一，酸奶的食用與胃癌發(fā)生率呈負相關(guān)關(guān)系[1,2]。

經(jīng)過千百年的自然馴化，新疆的傳統(tǒng)酸奶中蘊藏著豐富的有優(yōu)良特性的乳酸菌，其乳酸菌資源的生物多樣性是其他國家所沒有的[3]。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)過程中，產(chǎn)酸快的乳酸菌可以縮短發(fā)酵時間，提高生產(chǎn)效率，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益[4]。隨著近年來酸奶工業(yè)的快速發(fā)展，我國對于菌種資源的保護與開發(fā)利用越來越重視，新疆傳統(tǒng)酸奶作為優(yōu)良菌種的載體，受到越來越多的關(guān)注。

本研究運用傳統(tǒng)生理生化鑒定方法，結(jié)合16S rDNA序列同源性分析進行菌種鑒定，從新疆烏魯木齊地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中篩選具有優(yōu)良特性的乳酸菌，從而豐富發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑種類。

1 材料與方法

1.1 材料

6份酸奶樣品購買于新疆烏魯木齊牧民家庭。

試劑：MRS瓊脂培養(yǎng)基；改良MC培養(yǎng)基；M17培養(yǎng)基；細菌基因組DNA 提取試劑盒。

儀器：超凈工作臺；立式高壓滅菌鍋；電熱恒溫培養(yǎng)箱；厭氧操作箱；電顯微鏡；PCR儀；ATB微生物鑒定和藥敏分析儀。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取1mL樣品制成不同梯度的菌懸液，分別為10-3、10-4、10-53個梯度。取0.1mL菌懸液于MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基和改良MC培養(yǎng)基上均勻涂布，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h。選取細菌數(shù)量適中的平板，挑取有典型菌落形態(tài)的單菌落在MRS培養(yǎng)基上劃線純化，挑取純化菌落進行革蘭氏染色、鏡檢[5]。

1.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

從純化培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種于NaCl水溶液中稀釋，將菌液稀釋到標(biāo)準(zhǔn)比濁度，將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)液接種于試劑條，把試劑條放入ATB微生物鑒定儀中培養(yǎng)，24h后讀結(jié)果。

1.2.3 16S rDNA基因序列分析

采用細菌基因組D N A提取試劑盒提取乳酸菌的基因組D N A，并進行P C R擴增。引物為( 5'－AACGCGAAGAACCTTAC－3')和( 5'－CGGTGTGTACAAGACCC－3')。PCR反應(yīng)體系：引物各1μL，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，MgCl24μL，Taq酶0.5μL，模板DNA 2μL，用dd H2O補至50μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5min，循環(huán)（94℃變性1min，56℃退火45s，72℃延伸2min）30個，72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增產(chǎn)物送往山西兆恩因生物公司測序。

1.2.4 同源性分析

采用MEGA5中的鄰接法將測序結(jié)果與BLAST中獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA 基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化結(jié)果

培養(yǎng)皿中多為表面光滑、邊緣整齊、中央凸起的白色或半透明狀菌落。經(jīng)過純化培養(yǎng)，共分離純化到86株乳酸菌，經(jīng)革蘭氏染色都呈陽性。顯微鏡觀察菌體形態(tài)（圖1）：桿菌顯微形態(tài)為長桿狀或短桿狀，多數(shù)呈鏈狀排列；球菌呈圓形或卵圓形，以單個、成鏈或成片排列。進一步根據(jù)形態(tài)特征，挑選不同形態(tài)的30株乳酸菌進行進一步鑒定，標(biāo)記為L1～L30。

圖1 顯微鏡下的菌體形態(tài)

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

ATB微生物鑒定儀分析結(jié)果如表1所示。表中所顯示的%ID＞99、T＞0.75是非常好的鑒定，%ID＞90、T＞0.5是好的鑒定；ID值是根據(jù)待檢細菌各種不同生化反應(yīng)結(jié)果計算出的鑒定百分率，用其找出待檢菌在整個數(shù)據(jù)庫中應(yīng)屬于哪個分類單位。T值表示待檢菌的分類單位，其被確定以后，可根據(jù)T值來評定其與該分類單位中典型菌株的相似性，從而可以確定待檢菌在“種”中的典型程度[6]。

表1 微生物鑒定結(jié)果

30株菌株是根據(jù)在顯微鏡下菌體形態(tài)不同篩選出來的，分離菌株時從同一樣品中也分出很多不同的菌株，經(jīng)過生理生化鑒定后發(fā)現(xiàn)這些不同形態(tài)的菌屬于同種菌，但它們之間的生理生化特性卻有差異。L1、L8、L9、L15鑒定結(jié)果都是干酪乳桿菌，L1、L8、L9與干酪乳桿菌的特性符合，L15能利用木糖，這并不符合干酪乳桿菌的特性。

2.3 16S rDNA序列分析結(jié)果

擴增的片段經(jīng)測序后，進行BLAST同源序列搜索，根據(jù)16S rRNA 基因序列比對分析得出（圖2）：菌株L1、L9、L15、L8與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus casei處于同一分支，且相似度為100%，可將其鑒定為干酪乳桿菌；L2、L10、L13與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus paracasei處于同一分支，且相似度為100%，將其鑒定為副干酪乳桿菌；L3、L11、L14與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus plantarum相似度為99%，因此鑒定為植物乳桿菌；L4與菌株Lactobacillus rhamnosus相似度達100%，故鑒定其為鼠李糖乳桿菌；L5與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus reuteri處于同一分支，相似度達99%，將其鑒定為羅伊氏乳桿菌；L6、L20、L26與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus fermeutum相似度為100%，因此把其鑒定為發(fā)酵乳桿菌；L7與Lactobacillus gasseri標(biāo)準(zhǔn)菌株處于同一分支，相似度達100%，因此判定其為格氏乳桿菌；L12、L30與菌株Streptococcus thermophilus在同一分支，相似度為100%，因此將其鑒定為嗜熱鏈球菌；L16、L21、L25與Enterococcus faecium相似度為100%，將其鑒定為屎腸球菌；L17、L18、L24與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcus durans處于同一分支，相似度達99%，將其鑒定為堅強腸球菌；L19、L27與菌株Enterococcus hirae相似度為99%，因此判定其為腸道腸球菌；L22、L28與Lactobacillus curvatus標(biāo)準(zhǔn)菌株處于同一分支，相似度100%，故鑒定其為彎曲乳桿菌；L23與Enterococcus lactis相似度為99%，所以鑒定其為乳酸腸球菌；L29與標(biāo)準(zhǔn)菌株Streptococcus lutetiensis處于同一分支，相似度100%，所以將其鑒定為黃連鏈球菌。

圖2 30株乳酸菌16S rDNA基因序列的同源樹

3 討論

傳統(tǒng)酸奶中含有豐富的乳酸菌，隨著活菌自然生長，酸奶pH值會隨著時間的變化而降低，乳酸桿菌對酸的耐受性通常高于乳酸球菌。當(dāng)環(huán)境酸度較高時，乳酸球菌的生長受到抑制，耐酸性差的乳酸球菌難以存活，所以很難從酸奶中分離出乳酸球菌[7]。因此，將新鮮樣品放置于冰塊箱中冷藏，回到實驗室需立即進行采樣。傳統(tǒng)酸奶為多種菌株混合發(fā)酵，為保證能準(zhǔn)確分離傳統(tǒng)酸奶中所有乳酸菌，本研究的樣品稀釋倍數(shù)較低，分別在10-3、10-4、10-5濃度下分離菌株，以保證乳酸菌菌種不因稀釋倍數(shù)較大而缺失。

本試驗通過傳統(tǒng)方法結(jié)合16S rDNA序列同源性分析分離鑒定出86株、14種乳酸菌，包括了乳品以及發(fā)酵工業(yè)中常見的菌種，特別是很多有益生特性的菌種。乳桿菌屬有干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌和彎曲乳桿菌，其中植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌與前人研究結(jié)果一致，另外本研究篩選出了鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、格氏乳桿菌和彎曲乳桿菌。羅伊氏乳桿菌常棲息于人和動物的腸道系統(tǒng)中，能產(chǎn)生一種特殊的抑菌物質(zhì)——羅伊氏素，是調(diào)節(jié)腸道功能的益生菌[8]。研究表明鼠李糖乳桿菌對酸度耐受性較高，具有較好的益生特性，可作為今后開發(fā)功能性產(chǎn)品的潛在益生菌株[9]。彎曲乳桿菌所產(chǎn)生的細菌素具有很好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性，抑菌譜較廣，可作為天然的防腐劑[10]。腸球菌屬有屎腸球菌、堅強腸球菌、腸道腸球菌、乳酸腸球菌。鏈球菌屬有嗜熱鏈球菌和黃連鏈球菌。

新疆傳統(tǒng)酸奶是一個復(fù)雜的微生物體系，其中的乳酸菌資源具有無可比擬的生物多樣性和基因多樣性[11]。趙蕊等[12]篩選了新疆伊犁鞏留地區(qū)傳統(tǒng)酸奶的優(yōu)勢菌，共得到71株乳酸菌，包括32株球菌和39株桿菌，分別是乳桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬。蔣艾延[13]對塔城酸奶進行了分析，結(jié)果篩選出3個屬7個種，分別是植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、耐久腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、海氏腸球菌和乳酸片球菌，產(chǎn)酸快的是乳桿菌屬。袁雪林[14]運用可培結(jié)合非可培的PCR-DGGE技術(shù)對喀什地區(qū)酸奶進行分析研究，得到7種乳酸菌，分別是德氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、雞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、屎腸球菌、耐久腸球菌，其中優(yōu)勢菌是德氏乳桿菌。由此可見，地域、環(huán)境不同，傳統(tǒng)酸奶中蘊藏的乳酸菌種類也不完全相同。

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品源于多種菌株混合自然發(fā)酵，菌株之間直接相互作用，不僅豐富了酸奶的口感和產(chǎn)物，有利于人體健康，還能夠抵御噬箘體的污染。因此，研究開發(fā)這些菌株、制作多菌株的混合發(fā)酵劑，可促進乳品工業(yè)的快速發(fā)展。