王鈺潭，侯坤輝，王雪峰，趙存朝，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

我國(guó)西南部地區(qū)擁有豐富的水牛奶資源，水牛奶乳汁濃郁，味道醇香甜美，乳脂肪、乳蛋白、乳糖、常量礦物元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分要優(yōu)于其他奶源，是老少皆宜、不可多得的營(yíng)養(yǎng)佳品[1,2]。乳制品中蛋白肽的開發(fā)研究是當(dāng)前熱門研究課題，極具發(fā)展前景，其相關(guān)的研究對(duì)于后期投入生產(chǎn)有著重大的基礎(chǔ)作用與指導(dǎo)作用[3～5]。貫筋藤（Dregea sinensis hemsL）為蘿藦科南山藤屬植物，攀援木、質(zhì)藤本，俗稱“奶漿藤”，分布在我國(guó)云南大理、麗江地區(qū)及陜西、四川、貴州、甘肅等地[6]。貫筋藤蛋白酶是以貫筋藤為原材料提取而制成的一種天然植物凝乳劑，研究表明，其酶活性高、穩(wěn)定性好，是一種新型優(yōu)良的凝乳劑[7,8]。本試驗(yàn)在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了加工工藝，對(duì)比了不同凝乳劑添加和市場(chǎng)兩種水牛奶奶酪產(chǎn)品的奶酪蛋白肽各項(xiàng)指標(biāo)的活性差異，以期為以后開展水牛奶奶酪乳蛋白肽的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水牛奶：德宏州芒市畜牧站水牛奶牛合作社提供；發(fā)酵劑：FVV-221冷凍直投式干燥發(fā)酵劑，荷蘭皇家帝斯曼公司產(chǎn)品；凝乳劑：貫筋藤蛋白酶（GJTR，由本實(shí)驗(yàn)室提?。虡I(yè)木瓜蛋白酶（食品級(jí)）；對(duì)照組：兩種市售的水牛奶干酪（市售A和市售B）。

1.2 方法

1.2.1 水牛奶奶酪工藝流程

水牛奶→均質(zhì)→巴氏殺菌→接種發(fā)酵劑→加入凝乳酶攪拌→凝乳切割→排乳清堆釀→熱燙拉伸→成品。

1.2.2 蛋白肽提取工藝設(shè)計(jì)

干酪樣品切碎→稱取碎塊→根據(jù)設(shè)定好的料液比加入蒸餾水→均質(zhì)分離→高速冷凍離心→取上清液→超濾→冷凍干燥→干酪蛋白肽。

1.2.3 蛋白肽提取單因素試驗(yàn)

以干酪上清液肽得率為活性肽提取單因素指標(biāo)，對(duì)料液質(zhì)量比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、勻漿時(shí)間（2、4、6、8和10min）、轉(zhuǎn)速（9、11、13、15和17×1000r/min）三個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，研究各因素變量對(duì)干酪上清液肽得率的影響，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 肽得率的測(cè)定

多肽含量測(cè)定參考文獻(xiàn)方法[9,10]，略作修改。取2.5mL樣品溶液，加入2.5mL10%的三氯乙酸(TCA)水溶液混勻，靜置20min，然后在3 500r/min、4℃離心10min。取1.0mL上述溶液，加入雙縮脲試劑3.0mL混勻，60℃水浴顯色5min，2 000r/min、4℃離心10min[11]。取上清液于310nm處測(cè)定OD值，以谷胱甘肽（GSH）作為標(biāo)準(zhǔn)品，參考樣品中多肽測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，回歸方程為∶y=4.4062x-0.1449,R2=0.9978。1.2.5 二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液質(zhì)量比、勻漿時(shí)間、轉(zhuǎn)速3個(gè)因素，采用二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行3因素5水平試驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)因素水平表

1.2.6 超濾操作步驟

根據(jù)陳東平[13,14]等報(bào)道，分子量越小的肽其自由基清除作用越強(qiáng)、活性越高，本文設(shè)置了針對(duì)5k以下酪蛋白肽的提取與檢測(cè)，操作步驟如1.2.2。

1.2.7 蛋白肽的活性測(cè)定

1.2.7.1 抗氧化活性測(cè)定

（1）總抗氧化能力測(cè)定（TEAC）

根據(jù)文獻(xiàn)方法測(cè)定ABTS自由基清除能力[15,16]。吸取分子量5k以下的水牛奶干酪蛋白肽溶液500μL，加入734nm處吸光度為0.7～0.8的ABTS·+稀釋工作液3.8mL，室溫下反應(yīng)6min，于734nm處測(cè)定吸光值?？偪寡趸芰τ肁BTS自由基清除率表示，公式如下[17]∶

ABTS·自由基清除率（%）=[(s-sb)/(c-cb)]×100%

式中：s為ABTS·自由基清除能力吸光度；sb為樣品干擾試驗(yàn)吸光度；c為ABTS·工作液吸光度；cb為蒸餾水吸光度。

（2）還原能力測(cè)定（RP）

吸取分子量5k以下的水牛奶干酪蛋白肽溶液，加入pH6.6的0.2mol/L的PBS2.5mL，加入1%鐵氰化鉀溶液2.5mL，50℃反應(yīng)20min，加入10%TCA溶液2.5mL，4℃、5 000×g離心10min；吸取上清1mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL1%FeCl3溶液，于700nm處測(cè)定吸光度。以谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：

式中：y為吸光度，x為谷胱甘肽濃度。

（3）DPPH自由基清除能力測(cè)定（DPPH）

①DPPH自由基清除率化學(xué)法：

吸取分子量5k以下的水牛奶干酪蛋白肽溶液200μL，加入1.8g/mL的DPPH乙醇溶液2mL，充分振搖后，室溫下暗處反應(yīng)20min，于517nm處測(cè)定吸光值。DPPH自由基清除率采用如下公式計(jì)算∶

DPPH·清除率（%）=[(s-sb)/(c-cb)]×100%

式中：s為DPPH·自由基清除能力吸光度；sb為樣品干擾試驗(yàn)吸光度；c為DPPH甲醇溶液吸光度；cb為蒸餾水吸光度。

②DPPH薄層色譜-生物自顯影技術(shù)：

根據(jù)文獻(xiàn)方法[18]，稱取DPPH粉末96.70mg，加甲醇溶解并稀釋至刻度、搖勻，置于250mL棕色瓶，將DPPH溶液均勻地噴灑在薄層色譜硅膠G中，從左到右依次為蒸餾水空白組、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)組、實(shí)驗(yàn)組。

1.2.7.2 抑菌活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15,19]的方法測(cè)定抑菌率。取對(duì)數(shù)期細(xì)菌，以含有50mol/mL的NaCl和pH7.4的PBS水洗3遍后，用新鮮Luria-Bertani培養(yǎng)基重懸為1×105CFU/mL的菌懸液。將100μL（5、10、15、20、25mg/mL）GMP及P-GMP加入96孔酶標(biāo)板中，再加入等體積的菌懸液作為試驗(yàn)組；以100μL含有NaCl的PBS代替等體積水牛奶乳蛋白肽為對(duì)照組。在37℃培養(yǎng)12h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定600nm波長(zhǎng)處的OD值[20]。按如下公式計(jì)算酶解液的抑菌率：

抑菌率（%）=[(A對(duì)照組-A試驗(yàn)組)/A對(duì)照組]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白肽提取工藝

2.1.1 單因素試驗(yàn)分析

（1）最優(yōu)料液比的確定

圖1 料液比對(duì)多肽含量的影響

固定轉(zhuǎn)速為11×1000r/min，勻漿時(shí)間為2min，考察料液比對(duì)肽得率的影響。由圖1可以看出，隨著料液比的變化，肽得率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在料液比為25g/mL時(shí)肽得率最高。

（2）最優(yōu)勻漿時(shí)間的確定

圖2 勺漿時(shí)間對(duì)多肽含量的影響

固定轉(zhuǎn)速為11×1000r/min，料液比為1∶25，考察勻漿時(shí)間對(duì)肽得率的影響。由圖2可以看出，隨著勺漿時(shí)間的變化，肽得率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在勺漿時(shí)間為6min時(shí)肽得率最高。

（3）最優(yōu)勻漿轉(zhuǎn)速的確定

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)多肽含量的影響

固定勻漿時(shí)間為6min，料液比為1∶25，考察轉(zhuǎn)速對(duì)肽得率的影響。由圖3可以看出，隨著轉(zhuǎn)速的變化肽得率出現(xiàn)明顯的波動(dòng)趨勢(shì)。當(dāng)轉(zhuǎn)速過低時(shí)，上清液中的肽分子無(wú)法被充分破碎出來，隨著轉(zhuǎn)速的增加，料液與轉(zhuǎn)子之間的摩擦加大，料液受到的剪切力也增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速過快時(shí)，料液與轉(zhuǎn)子接觸的時(shí)間減少，故肽得率降低。因此轉(zhuǎn)速選擇11×1000r/min時(shí)最佳。

2.1.2 數(shù)學(xué)模型的建立與檢測(cè)

二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。利用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型為：

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（見表3）。由表3可知，該回歸模型達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說明方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠反映肽得率提取效果與液料比、勻漿時(shí)間和勻漿轉(zhuǎn)速的關(guān)系。

2.1.3 變量輪換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）范圍內(nèi)，每個(gè)因素取5個(gè)水平（±1.682，±1，0），對(duì)53=125個(gè)方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)可得肽得率的最高值為0.54，此時(shí)各因素取值為：X1=0，X2=-1.682，X3=0，對(duì)應(yīng)著液料比25∶1，勻漿時(shí)間2.64min，勻漿轉(zhuǎn)速11×1000r/min。

2.1.4 頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)

對(duì)不同設(shè)計(jì)水平下的組合進(jìn)行模擬試驗(yàn)，以均值0.4765為臨界值，獲得大于臨界值的方案50個(gè)，各變量取值的頻率分布見表4。由表4可以看出，在95%的置信區(qū)間肽得率大于0.4765的優(yōu)化方案為：料液比為26.61～28.40，勻漿時(shí)間為5.11～6.88，轉(zhuǎn)速為10.42～11.58。為了貼近實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：料液比為26∶1，勻漿時(shí)間為5min，轉(zhuǎn)速為10×1000r/min。

表3 回歸方程方差分析表

表4 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表

2.2 水牛奶干酪蛋白肽的功能活性

2.2.1 抗氧化活性

（1）總抗氧化能力（TEAC）

由圖4可知，隨著水牛奶干酪蛋白肽濃度的提高，ABTS自由基清除活性均有增強(qiáng)。木瓜蛋白酶組的ABTS自由基清除活性最強(qiáng)，10mg/mL時(shí)ABTS清除活性為85.63%；貫筋藤酶組的干酪蛋白肽濃度為10mg/mL時(shí)ABTS清除活性為82.22%；兩種市售干酪在蛋白肽濃度為10mg/mL時(shí)ABTS清除活性分別為84.55%和83.79%。

圖4 5K以下蛋白肽ABTS自由基清除率

（2）還原能力（RP）

圖5 5K以下蛋白肽還原能力

由圖5可以看出，市售A組的干酪蛋白肽還原能力明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，其余三組之間差異不大。市售A組在濃度為10mg/mL時(shí)還原能力為69.43%；貫筋藤酶組的干酪蛋白肽濃度為10mg/mL時(shí)還原能力為52.96%，其差異或許與其生產(chǎn)工藝不同有關(guān)。

（3）自由基清除能力（DPPH）

圖6 5K以下蛋白肽DPPH自由基清除率

由圖6可以看出，市售A組的干酪蛋白肽DPPH自由基清除活性稍高于其他實(shí)驗(yàn)組，其余三組之間差距不大；市售A組的干酪蛋白肽濃度在10mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除能力達(dá)到62.64%，貫筋藤組相對(duì)較低，僅有52.63%的DPPH自由基清除能力。

（4）DPPH薄層色譜

圖7 5k以下蛋白肽DPPH薄層色譜

從圖7可以看出，木瓜蛋白酶組的抗氧化活性最好，其后依次為市售A組、市售B組、貫筋藤酶組。

2.2.2 抑菌活性

（1）李斯特菌抑菌率

圖8 李斯特菌抑菌率

由圖8可知，各濃度的貫筋藤酶組蛋白肽均對(duì)代表革蘭氏陽(yáng)性菌的李斯特菌抑菌能力最強(qiáng)。在濃度為25mg/mL的濃度下，貫筋藤酶組的抑菌率高達(dá)86.33%，市售B組干酪的蛋白肽對(duì)李斯特菌的抑菌能力較弱。

（2）沙門氏菌抑菌率

圖9 沙門氏菌抑菌率

由圖9可知，市售A組與木瓜蛋白酶組對(duì)革蘭氏陰性菌沙門氏菌的抑菌效果最好，在濃度為25mg/mL時(shí)抑菌率分別為61.87%和61.68%；貫筋藤組對(duì)沙門氏菌的抑菌能力相對(duì)較弱，為55.36%。四種干酪的不同濃度蛋白肽對(duì)李斯特菌、沙門氏菌均有抑制作用。

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗(yàn)與二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)確定了料液比為26∶1、勻漿時(shí)間為5min、轉(zhuǎn)速10×1000r/min時(shí)為蛋白肽最佳提取工藝（蛋白肽提取率最高）。通過測(cè)定最佳提取條件下蛋白肽的抗氧化活性及抑菌作用，貫筋藤凝乳酶和木瓜蛋白酶加工得到的水牛奶奶酪中的蛋白肽具有較好的ABTS、DPPH自由基清除能力及鐵離子還原能力；水牛奶干酪蛋白肽對(duì)李斯特菌、沙門氏菌均有良好的抑制作用。此研究表明水牛奶奶酪中富含功能活性肽，具有很大的開發(fā)價(jià)值。