康 玨，段麗麗*，戢得蓉，唐菊蓮，楊曉儀

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 組織人事處，四川 成都 610100；2.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，四川 成都 610100）

啤酒花（Humulus lupulusL.）學(xué)名蛇麻，又稱香蛇麻、蛇麻草、忽布，是蕁麻目大麻科草屬多年生草本植物，簡稱酒花[1-2]。酒花是啤酒釀造過程中必不可少的原料，不僅能賦予啤酒獨(dú)特的風(fēng)味，還具有防腐抑菌功能，被譽(yù)為“啤酒的靈魂”，同時具有抗腫瘤、降血糖、健胃、消食、利尿等功效[3-4]，其主要化學(xué)成分為樹脂類、揮發(fā)油、多酚類、黃酮類等[5]，并且其中同綠茶和葡萄多酚一樣具有前途功能性成分的多酚物質(zhì)含量占啤酒花總質(zhì)量的4%～14%[6-8]，如異戊烯基查爾酮，具有廣譜抗菌、抗氧化等作用[9]。近年來，啤酒花抗氧化性的研究越來越多，在一些抗癌機(jī)理研究中啤酒花展現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，也有報道顯示，酒花中的多酚能消除羥基自由基、超氧陰離子等，且清除能力強(qiáng)于Trolox。另外其化學(xué)組成中的含硫化合物和酚酸也有助于提高酒花的天然抗氧化能力。

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們對飲食健康的重視，保健類飲品越來越成為消費(fèi)者的首選。因葡萄酒中含有大量的酚類物質(zhì)，故適量飲用能預(yù)防脈粥樣硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生并起到保健的作用[10-12]。葡萄酒長期以來都是用添加SO2來延長保質(zhì)期，但過量的SO2不僅影響葡萄酒的品質(zhì)，而且會對人體健康造成危害，特別是對含有SO2的葡萄酒過敏的群體，如哮喘病患者[13]。有研究顯示，規(guī)定添加量條件下，SO2并不能在紅葡萄酒中表現(xiàn)出較好的抗氧化性，因此，尋找一種能替代或是能較少添加SO2的抗氧化物質(zhì)極為重要。目前，國內(nèi)外對葡萄酒中的新型抗氧化劑研究甚多，但是將酒花的抗氧化活性在葡萄酒中的應(yīng)用未見報道。

由于斯伯特酒花在眾多酒花種類中的抗氧化性最高，抗氧化活性范圍為70%～80%[14]，因此，本實(shí)驗(yàn)將其應(yīng)用于葡萄酒中，研究斯伯特酒花添加量對葡萄酒抗氧化活性和葡萄酒品質(zhì)的影響，篩選出最佳的酒花添加量，為提升葡萄酒的品質(zhì)和衍生酒花資源的生產(chǎn)鏈提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄：成都金滿堂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；斯伯特酒花：河南省帕洛丁貿(mào)易有限公司；果膠酶（50 000 U/g）：寧夏和氏壁生物技術(shù)有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

檸檬酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、無水碳酸鈉、干沒食子酸、甲醇、過硫酸鉀（均為分析純）：成都潤澤本土化工有限公司；2,2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽[2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）]：上海安耐吉化學(xué)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）：日本TCL公司；水溶性維生素E（Trolox）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司第一分公司；福林肖卡試劑：廈門海標(biāo)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-BlueStarA紫外-可見分光光度計：北京萊博泰科儀器有限公司；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；ScoutSE電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；101-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒花浸出物的制備

取200mL蒸餾水加熱至100℃且保持2 min，加入0.20 g斯伯特酒花，熬制4 min，待其冷卻后過濾，濾液備用。

1.3.2 酒花葡萄酒釀造工藝及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

選取成熟度高、無霉?fàn)€變質(zhì)及無病蟲害的新鮮葡萄，清水沖洗、去皮以及取出葡萄籽，除梗，將其破碎。根據(jù)果漿的質(zhì)量添加果膠酶，50℃條件下水浴酶解2 h。將酒花浸出物按不同比例加入，使其浸漬并參與之后的葡萄酒發(fā)酵過程。過濾澄清，添加糖調(diào)整酒樣總糖度至22°Bx。接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的酵母，在20～25℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)葡萄酒酒體表面無明顯氣泡產(chǎn)生，酵母生長量、殘?zhí)呛颗c酒精度等趨于穩(wěn)定說明主發(fā)酵結(jié)束。主發(fā)酵結(jié)束后，將葡萄酒靜置澄清、過濾，移入新的發(fā)酵容器于5℃進(jìn)行低溫陳釀，陳釀結(jié)束后移入容器貯存。

1.3.3 酒花添加量的優(yōu)化

因考慮不同酒花浸出物添加量對葡萄酒抗氧化活性的影響，在進(jìn)行葡萄酒釀造時，設(shè)置四個酒花添加量比例（酒花浸出物∶葡萄酒）為1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，分別編號為處理1、處理2、處理3、處理4。以未添加酒花浸出物的酒樣為空白對照CK，發(fā)酵結(jié)束后，在自然氧化期間第0、30、60、90、120、150天時取樣，檢測總酚含量、褐變程度及抗氧化活性及感官指標(biāo)，通過分析優(yōu)化出酒花浸出物的最佳添加量。

1.3.4 總酚含量測定

采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法[15]。取1mL被稀釋10倍后的葡萄酒酒樣置于100 mL容量瓶中，依次加入5.0 mL福林肖卡試劑和15mL20%碳酸鈉溶液，用去離子水定容至100mL，將混合液在室溫避光條件下反應(yīng)2h后于波長760nm處測定吸光度值。再代入回歸方程計算總酚含量，結(jié)果用沒食子酸等價表示，單位為mg/L沒食子酸。

1.3.5 褐變程度測定

褐變程度測定采用吸光值法[16]。采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH=3.2）調(diào)零，使用紫外-可見分光光度計分別檢測各酒樣在波長520nm、420nm處的吸光度值。以A520nm值代表酒樣氧化后的紅色色調(diào)，A420nm值代表褐變程度。

1.3.6 ABTS自由基清除能力[17-18]

于波長734 nm處測定酒樣的吸光度值，以Trolox建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程后計算ABTS自由基清除能力，結(jié)果以Trolox當(dāng)量抗氧化能力（Trolox equilent antioxidant capacity，TEAC）值表示，單位為μmol/L。

1.3.7 DPPH自由基清除能力[19]

取0.1mL稀釋后的酒樣加入3.9mLDPPH甲醇溶液中，避光反應(yīng)20 min，同時以無水乙醇為空白，于波長517 nm處測定吸光度值，結(jié)果以Trolox當(dāng)量抗氧化能力（TEAC）值表示，單位為μmol/L。

1.3.8 感官評價

請10名對葡萄酒具有鑒賞能力的消費(fèi)者，參照《“亞洲葡萄酒質(zhì)量大賽（靜止葡萄酒）”品嘗記錄表》及葡萄酒品嘗相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[20-21]，對斯伯特酒花葡萄酒的香氣、口感、外觀以及整體進(jìn)行評分和描述性分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010處理并用SPSS21.0對總酚含量和抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量變化

按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.000 9x-0.058 6計算各酒樣總酚含量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，各酒樣總酚含量在150 d后都有所下降，從自然氧化第0天的296.22～312.88 mg/L下降至第150天的259.91～277.14 mg/L，處理4的酒樣變化最小，僅為22.39 mg/L。加入了斯伯特酒花的樣品在試驗(yàn)階段，總酚含量均高于空白對照，處理4的總酚含量分別是空白對照、1∶10、1∶8、1∶6葡萄酒的1.07、1.05、1.04和1.02倍，且長時間儲存后變化最小，進(jìn)一步說明斯伯特酒花的加入能延緩葡萄酒總酚含量的降低。

圖1 酒樣總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenol content in wine samples

2.2 褐變程度變化

總酚類物質(zhì)中的花色苷決定著葡萄酒顏色和色度，不同儲存時間的酒樣在波長420 nm和520 nm處的吸光度值見圖2。

圖2 酒樣紅色色調(diào)及褐變程度隨時間的變化Fig.2 Changes of wine red and browning degree with time

由圖2a可知，各酒樣紅色色調(diào)（A520nm）整體呈現(xiàn)出下降趨勢，其原因在于游離花色苷向聚合花色苷的轉(zhuǎn)變加上在緩慢的自然氧化過程中沒有大量醌類物質(zhì)生成。葡萄酒褐變的原理多認(rèn)為是酒中的酚類物質(zhì)被氧氣成醌和H2O2，再進(jìn)行縮聚反應(yīng)生成褐色素。在試驗(yàn)過程中，氧氣的進(jìn)入使得葡萄酒氧化；由圖2b可知，酒樣的褐變（A420nm）趨勢為先下降后增加最后又降低，加入斯伯特酒花的酒樣整體褐變程度均小于空白對照組，斯伯特酒花的存在使得酒樣中還原性酚類物質(zhì)增加，使醌和其他聚合物又被還原為酚從而減緩了酒樣的氧化褐變，通過比較不同處理酒樣的褐變程度，效果最好的為處理4。

2.3 ABTS自由基清除能力變化

ABTS自由基清除能力實(shí)驗(yàn)是測定化合物抗氧化能力的重要方法[22]，ABTS原溶液與過硫酸鉀在室溫黑暗環(huán)境中反應(yīng)12～16 h產(chǎn)生ABTS+自由基，供氫抗氧化劑的存在會使ABTS自由基減少[23]。

酒樣ABTS自由基清除能力的變化結(jié)果見圖3。由圖3可知，在試驗(yàn)中，各酒樣的ABTS自由基清除能力隨著儲存時間推移而降低，說明氧化褐變的葡萄酒抗氧化活性呈下降趨勢，TEAC值由第0天的1 662.3～1 771.4 μmol/L下降至第150天的987.1～1 036.2 μmol/L，變化量從大到小的順序?yàn)镃K＞處理1＞處理2＞處理3＞處理4。由此可見，加入了斯伯特酒花浸出物酒樣的ABTS自由基清除能力較空白組更好，自由基的產(chǎn)生與清除的平衡受制于抗氧化物質(zhì)[24]，故斯伯特酒花浸出物的加入可能增加了葡萄酒中的抗氧化物質(zhì)從而提高其自由基清除能力，增強(qiáng)酒樣的抗氧化活性。

圖3 酒樣ABTS自由基清除能力的變化Fig.3 Changes of ABTS free radical scavenging ability of wine samples

2.4 DPPH自由基清除能力變化

酒樣DPPH自由基清除能力的變化見圖4。由圖4可知，隨著儲存時間的延長，各酒樣清除DPPH自由基的能力先上升后下降，而在試驗(yàn)整個階段整體上呈下降趨勢，表明氧化褐變的葡萄酒的抗氧化活性總體是呈下降趨勢的，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因有可能是葡萄酒中的抗氧化物質(zhì)含量的降低以及氧氣的影響。在試驗(yàn)中，各酒樣都呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制DPPH自由基的能力，與空白組相比，加入了斯伯特酒花浸出物的葡萄酒在整個檢測階段呈現(xiàn)出更好的抑制DPPH自由基的能力。根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，認(rèn)為斯伯特酒花浸出物能提高葡萄酒抑制DPPH自由基的能力，其原因可能在于斯伯特酒花豐富的酚類物質(zhì)與葡萄酒相融合，提高了抗氧化能力，具有較好效果的是處理4的斯伯特酒花葡萄酒。

圖4 酒樣DPPH自由基清除能力的變化Fig.4 Changes of DPPH free radical scavenging ability of wine samples

2.5 總酚含量與抗氧化活性指標(biāo)相關(guān)性分析

為了避免偶然因素對葡萄酒抗氧化活性造成的影響，采用ABTS法和DPPH法兩種方法對斯伯特酒花葡萄酒的抗氧化活性進(jìn)行測定。通過軟件SPSS21.0對不同酒樣的總酚含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

表1 不同酒樣總酚與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between total phenols and antioxidant activity in different wine samples

由表1可知，總酚含量與抗氧化活性指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），總酚含量與ABTS自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.880～0.924，總酚含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.862～0.918（P＜0.05），說明酒花葡萄酒的總酚含量是自由基清除能力變化的主要影響因素，與CK對比，添加了斯伯特酒花的酒樣（處理組1～4）的總酚與抗氧化活性的相關(guān)性均高于CK，而在一般情況下，相關(guān)性增強(qiáng)，其酚類化合物對抗氧化能力亦隨之提高[25]，故在葡萄酒釀造過程加入斯伯特酒花能夠增強(qiáng)酒樣的抗氧化活性，可能是因?yàn)榫苹ㄖ懈吆康姆宇愇镔|(zhì)在發(fā)酵過程能夠增加酒樣的總酚含量，效果最好的為處理4。

2.6 感官評價

經(jīng)過150 d的自然氧化后，各酒樣的感官品質(zhì)評價結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過150 d的自然氧化后，各酒樣的品質(zhì)整體偏低。以葡萄酒的感官評分作為評價指標(biāo)，隨著斯伯特酒花浸出物添加量的增加，酒樣口感受到影響，感官質(zhì)量有所提高，斯伯特酒花獨(dú)特的香味融入到葡萄酒中，使得葡萄酒呈現(xiàn)出獨(dú)特的酒花香味。斯伯特酒花中大量的抗氧化物質(zhì)讓葡萄酒的氧化延緩，故加入了斯伯特酒花浸出物的酒樣整體得分高于空白對照組，且斯伯特酒花浸出物添加越多，感官提高效果越佳，最優(yōu)的為處理組4。

表2 酒樣的感官品質(zhì)Table 2 Sensory quality of wine samples

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過酒花浸出物的不同添加量對葡萄酒自然氧化階段葡萄酒各項指標(biāo)影響的研究，探索葡萄酒中最佳的酒花添加量，為酒花在葡萄酒的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。研究結(jié)果表明：

（1）在自然氧化150 d后，酒花添加量最多（酒花浸出物∶葡萄酒=1∶4）的葡萄酒總酚含量平均達(dá)到304.20 mg/L沒食子酸，分別是空白對照、酒花浸出物∶葡萄酒1∶10、1∶8、1∶6酒樣的1.07、1.05、1.04和1.02倍，說明酒花浸出物添加比例為1∶4的酒樣總酚含量最高，且長時間儲存后其總酚含量降低程度亦最小，進(jìn)一步體現(xiàn)了斯伯特酒花的加入能延緩總酚含量的降低。

（2）在試驗(yàn)期間，酒樣紅色色調(diào)呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，酒樣的褐變程度為先下降后增加最后又降低，從整體上看，加入斯伯特酒花的酒樣整體褐變程度均小于空白對照組。

（3）各酒樣的ABTS自由基清除能力和抑制DPPH自由基能力均隨著時間推移而降低，加入斯伯特酒花浸出物的酒樣自由基清除能力較空白組更好，且酒花添加比例為1∶4的酒樣抗氧能力提高效果最佳。

（4）酒樣總酚含量與抗氧化活性指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），總酚含量與ABTS自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.880～0.924，與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.862～0.918（P＜0.05），說明酒花葡萄酒的總酚含量是自由基清除能力變化的主要影響成分，且處理組1～4的相關(guān)性均高于CK，進(jìn)而說明酒花的添加能增強(qiáng)葡萄酒的抗氧化活性。

（5）感官評價表明，經(jīng)過150 d的自然氧化后，各酒樣的品質(zhì)整體偏低，斯伯特酒花浸出物添加量的增加對各酒樣感官評分有促進(jìn)作用，酒花浸出物與酒添加量比例為1∶4時感官評分最高，為75分，未添加酒花的葡萄酒最低。故斯伯特酒花浸出物添加越多，感官提高效果越佳。