郭彥偉，聶 聰*，關(guān)雪芹，張 潔，楊貴恒

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250030）

啤酒花（Humulus lupulus L.）為蕁麻目大麻科葎草屬植物多年生草質(zhì)蔓生藤本植物的雌性球穗花序[1-2]。啤酒花主要用于啤酒釀造，其能夠保證啤酒的品質(zhì)并賦予啤酒獨(dú)特的風(fēng)味，被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[2-3]。啤酒花主產(chǎn)于歐洲、美國(guó)、中國(guó)、澳大利亞等地。我國(guó)種植地主要集中在新疆、甘肅等地[4]。近年來(lái)，精釀啤酒迅猛發(fā)展，對(duì)啤酒花數(shù)量和質(zhì)量都有了很高的要求。酒花主要成分包括酒花樹(shù)脂、酒花油和多酚物質(zhì)，為啤酒提供香味、苦味[5-6]。啤酒的苦味主要由α-酸的異構(gòu)化、異α-酸、β-酸的氧化物、酒花多酚等物質(zhì)形成[5，7-8]。酒花油的成分非常復(fù)雜，目前已經(jīng)成功鑒定出了485種物質(zhì)，并推測(cè)酒花油中約存在1 000種物質(zhì)[7]。酒花多酚物質(zhì)是天然的抗氧化劑，參與抗氧化過(guò)程[9-10]。不同的酒花添加方式對(duì)啤酒風(fēng)味的影響有著很大差別，在麥汁煮沸開(kāi)始時(shí)添加酒花，能使啤酒體現(xiàn)苦味。在儲(chǔ)酒期添加酒花，可以使啤酒具有清新的鮮酒花風(fēng)味[7]。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）因其具有檢測(cè)特定離子碎片的功能，使得對(duì)未知化合物的定性更加準(zhǔn)確，也因此被廣泛應(yīng)用于啤酒中酒花香氣物質(zhì)的定性和定量研究[11]。1978年有學(xué)者使用GC-MS鑒定出德國(guó)啤酒中超過(guò)110種酒花香氣物質(zhì)[12-13]。然而，由于啤酒基體的復(fù)雜性以及酒花香氣物質(zhì)在啤酒中僅微量存在，對(duì)啤酒樣品前處理顯得十分重要，目前最方便和流行的前處理方式是頂空固相微萃?。╤ead space-solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)[14]，其具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[9，15]。其所需樣品量小，同時(shí)無(wú)需萃取溶劑，大大節(jié)省了溶劑消耗，而且氣體樣品能夠直接進(jìn)行萃取分離，大大提高了氣體樣品的萃取效率。

采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GCMS）聯(lián)用的方法[16-17]，對(duì)中國(guó)、美國(guó)和新西蘭Cascade顆粒酒花中香氣化合物的組成進(jìn)行檢測(cè)分析，分別與Cascade酒花在麥汁時(shí)添加酒花酒樣的香氣化合物和啤酒儲(chǔ)存期干投后酒樣的香氣化合物進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)分別進(jìn)行感官品評(píng)。既能夠?qū)θ齻€(gè)國(guó)家的Cascade酒花的香氣化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，又可以對(duì)添加該酒花的啤酒進(jìn)行感官分析對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年份Cascade酒花：分別產(chǎn)自中國(guó)新疆地區(qū)、美國(guó)俄勒岡州產(chǎn)區(qū)、新西蘭。均使用鋁箔袋抽真空并冷凍保存于冰箱。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀、HP-5（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）：美國(guó)Agilent公司[18]；聚二甲基硅氧烷StableFlex固相萃取頭：Sigma-Aldrich公司；DVB-CAR-PDMS型頂空固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 頂空固相微萃?。℉S-SPME）法提取顆粒酒花香氣成分

準(zhǔn)確稱取8.0 g酒花顆粒樣品，粉碎后立即置于50 mL頂空樣品瓶中，密封瓶口，將樣品置于恒溫水浴鍋中，50℃預(yù)熱5 min。然后連接固相微萃取裝置對(duì)酒花香氣成分進(jìn)行吸附（實(shí)驗(yàn)前先將萃取頭老化5 min），50℃條件下固相微萃取45 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，進(jìn)行解吸。

1.3.2 頂空固相微萃?。℉S-SPME）法提取酒樣中的酒花香氣成分

分別取煮沸時(shí)添加Cascade酒花和干投Cascade酒花的啤酒樣品20 mL，加入50 mL頂空樣品瓶中，放入磁子，密封瓶口，將樣品瓶放在磁力攪拌加熱器上，攪拌速度為200 r/min，40℃預(yù)熱5 min，然后連接固相微萃取裝置對(duì)酒花香氣成分進(jìn)行吸附，40℃固相微萃取45 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，進(jìn)行解吸。

1.3.3 感官品評(píng)

將三個(gè)國(guó)家的Cascade顆粒酒花以及煮沸時(shí)添加酒花的酒樣和干投酒花后的酒樣分別進(jìn)行感官品評(píng)。由齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）中德啤酒技術(shù)中心師生和兩位國(guó)家級(jí)品酒師組成10人（5男5女）品評(píng)小組對(duì)酒樣進(jìn)行品評(píng)。從柑橘香、水果香、花香、草藥香、香料香五個(gè)方面進(jìn)行品評(píng)打分，每個(gè)方面為0～5分。

1.3.4 色譜條件

載氣：高純氦氣（He）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣流速：1 mL/min；分流比：30∶1；柱室程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以5℃/min速率升至210℃，保持3 min。

質(zhì)譜檢測(cè)器，電子電離（electron ionization，EI）源，質(zhì)量掃描范圍（m/z）30～400，四級(jí)桿溫度150℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，電子倍增器電壓1 400 V[19]。

1.3.5 定性及定量方法

定性方法：化合物在GC-MS上的采集信息通過(guò)Masshunter Workstation B.03.01數(shù)據(jù)處理軟件處理。美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫(kù)2.0檢索。

定量方法：通過(guò)Agilent自帶的化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，并用氣相色譜峰面積歸一法定量計(jì)算出各化學(xué)成分在酒花中的峰面積的相對(duì)含量[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)不同國(guó)家Cascade酒花香氣對(duì)比分析

在氣相色譜條件下，可以分離出100多種成分，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫(kù)及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，從新西蘭Cascade酒花鑒定出31種物質(zhì)，美國(guó)Cascade酒花鑒定出23種物質(zhì)，中國(guó)Cascade酒花鑒定出17種物質(zhì)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，相比較于新西蘭Cascade酒花，中國(guó)Cascade酒花沒(méi)有檢測(cè)到α-蒎烯、依蘭烯、α-金合歡烯、α-杜松烯、羅勒烯，異丁酸異戊酯、異丁酸-2-甲基丁酯、2-甲基丁酸香葉酯、丁酸香葉酯，芳樟醇、香葉醇，2-十一酮、2-十三酮以及γ-亞麻酸。美國(guó)Cascade酒花沒(méi)有檢測(cè)到異丁酸異丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、2-甲基丁酸香葉酯，羅勒烯、α-杜松烯，2-十三酮及γ-亞麻酸。中國(guó)Cascade酒花香味物質(zhì)沒(méi)能完全體現(xiàn)Cascade酒花作為苦香兼優(yōu)酒花的功效。

表1 三個(gè)不同國(guó)家的Cascade顆粒酒花香氣成分Table 1 Aroma compounds of granular Cascade hops from three different countries

2.2 三個(gè)不同國(guó)家酒花在煮沸時(shí)添加酒樣酒花香氣對(duì)比分析

在氣相色譜條件下，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫(kù)及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，在煮沸過(guò)程中添加Cascade酒花，新西蘭鑒定出17種香氣物質(zhì)，美國(guó)酒花鑒定出7種香氣物質(zhì)，中國(guó)酒花鑒定出10種香氣物質(zhì)。結(jié)果如表2所示。

由表2可知，在煮沸時(shí)添加酒花，酒樣中的香氣物質(zhì)都比較少。相比較，酒樣中酒花香氣物質(zhì)含量最豐富的是新西蘭Cascade酒花，香氣物質(zhì)含量居中的是中國(guó)Cascade酒花，香氣物質(zhì)含量最少的是美國(guó)Cascade酒花。相比較于煮沸時(shí)添加的新西蘭Cascade酒花，中國(guó)Cascade酒花在煮沸時(shí)添加檢測(cè)到異戊醛和2-甲基丁醛兩種香味物質(zhì)。異戊醛天然存在于柑桔、檸檬等精油中。高度稀釋時(shí)有似蘋果香氣，質(zhì)量濃度＜10.0 mg/L時(shí)呈桃子香味。說(shuō)明中國(guó)Cascade酒花煮沸后會(huì)產(chǎn)生新的柑橘、檸檬、蘋果或桃子的香味。沒(méi)有檢測(cè)到丙酸-2-甲基丁酯、異丁酸異戊酯、異戊酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯、丁酸香葉酯，2-十一酮及氧化石竹烯。美國(guó)Cascade酒花只檢測(cè)到丙酸-2-甲基丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯，月桂烯、d-檸烯、石竹烯、葎草烯及芳樟醇?？傊珻ascade酒花不適合在煮沸鍋中加入，香氣物質(zhì)損失很大，可以嘗試其他添加方法，會(huì)使酒花利用率提高。

表2 煮沸時(shí)添加三個(gè)不同國(guó)家的Cascade酒花的酒樣香氣成分Table 2 Aroma compounds of beer samples adding Cascade hops from three different countries during boiling

2.3 三個(gè)不同國(guó)家酒花干投后酒樣香氣物質(zhì)對(duì)比分析

在氣相色譜條件下，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫(kù)及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，新西蘭Cascade酒花在儲(chǔ)存期干投后酒樣酒花香氣物質(zhì)鑒定出27種物質(zhì)，美國(guó)Cascade酒花干投后酒樣酒花香氣物質(zhì)鑒定出23種物質(zhì)，中國(guó)Cascade酒花干投后酒樣酒花香氣物質(zhì)鑒定出20種物質(zhì)。結(jié)果如表3所示。

由表3可知，干投Cascade酒花后，相比較于新西蘭Cascade酒花，美國(guó)Cascade酒花檢測(cè)到丙醇、2-十一酮、β-瑟林烯三種新西蘭Cascade酒花中沒(méi)有的物質(zhì)。而未檢測(cè)到乙酸-2-甲基丁酯、異丙酸異丁酯、丙酸-3-甲基丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、乙酸香葉酯、丁酸芳樟酯。中國(guó)Cascade酒花檢測(cè)到丙醇一種新西蘭Cascade酒花中沒(méi)有的物質(zhì)。而未檢測(cè)到異丙酸異丁酯、丙酸-3-甲基丁酯、異丁酸異戊酯、4-癸烯酸甲酯、丁酸芳樟酯，D-檸烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯、δ-杜松烯烯類物質(zhì)以及2-十一酮?？傊赏逗驝ascade酒花的香氣都得到了很好的體現(xiàn)。三個(gè)國(guó)家的Cascade酒花較適合干投，干投酒花的利用率最高。

表3 三個(gè)不同國(guó)家的Cascade酒花干投后酒樣中香氣物質(zhì)Table 3 Aroma compounds of beer samples dry hopping Cascade hops from three different countries

2.4 三個(gè)國(guó)家的Cascade酒花香氣及其酒樣的感官品評(píng)

Cascade顆粒酒花中，新西蘭酒花的柑橘香、水果香和香料香較突出；煮沸過(guò)程中添加Cascade酒花，中國(guó)酒花的水果香和柑橘香較突出，美國(guó)酒花的草藥香較突出；在儲(chǔ)存期干投Cascade酒花，新西蘭酒花的柑橘香、水果香較突出，美國(guó)酒花的草藥香和香料香較突出。Cascade酒花香氣及其酒樣的感官品評(píng)的香氣雷達(dá)圖如圖1所示。

圖1 顆粒酒花香氣（A）、煮沸時(shí)添加酒花酒樣香氣（B）、干投酒花酒樣香氣（C）雷達(dá)圖Fig.1 Aroma radar map of granular Cascade hops(A)and beer samples adding hops during boiling(B)and dry hopping(C)

由Cascade酒花香氣雷達(dá)圖（圖1）可知，Cascade酒花不適合在煮沸時(shí)添加，適合干投，干投可以將酒花的香氣物質(zhì)很好的體現(xiàn)在酒樣中。Cascade酒花及酒樣的感官品評(píng)結(jié)果與GC-MS檢測(cè)的結(jié)果基本相符合。

2.5 三個(gè)國(guó)家的Cascade酒花及酒樣香氣物質(zhì)數(shù)量變化

三個(gè)國(guó)家的Cascade顆粒酒花香氣物質(zhì)以及在煮沸時(shí)添加酒花酒樣中的酒花香氣物質(zhì)和在儲(chǔ)存期干投酒花檢測(cè)到的酒花香氣物質(zhì)數(shù)量對(duì)比如圖2所示。

圖2 Cascade酒花及其酒樣香氣物質(zhì)種類變化Fig.2 Quantity changes of aroma compounds in Cascade hops and beer samples

與Cascade顆粒酒花的香氣化合物相比較，新西蘭Cascade酒花在麥汁煮沸過(guò)程中添加香氣化合物減少17種，增加3種，在啤酒儲(chǔ)存期干投香氣物質(zhì)減少19種，增加12種；美國(guó)Cascade酒花在麥汁煮沸過(guò)程中添加香氣化合物減少18種，增加2種，在啤酒儲(chǔ)存期干投香氣物質(zhì)減少12種，增加12種；中國(guó)Cascade酒花在麥汁煮沸過(guò)程中添加香氣化合物減少12種，增加5種，在啤酒儲(chǔ)存期干投香氣物質(zhì)減少11種，增加14種。減少的主要是萜烯類物質(zhì)，增加的主要是醇和酯類物質(zhì)。Cascade酒花更適合干投，不適合添加到煮沸鍋中。干投可以提高Cascade酒花的利用率。

3 結(jié)論

Cascade顆粒酒花香氣化合物主要包括β-蒎烯、月桂烯、D-檸烯、香葉酸甲酯、古巴烯、乙酸香葉酯、石竹烯、蓽澄茄烯、香檸檬烯、β-金合歡烯、葎草烯、杜松烯、瑟林烯等物質(zhì)。新西蘭Cascade顆粒酒花酒花鑒定出31種物質(zhì)，美國(guó)Cascade酒花鑒定出23種物質(zhì)，中國(guó)Cascade酒花鑒定出17種物質(zhì)。新西蘭Cascade顆粒酒花的香氣物質(zhì)最豐富。與Cascade顆粒酒花的香氣化合物相比較，新西蘭Cascade酒花在麥汁煮沸過(guò)程中添加和在啤酒儲(chǔ)存期干投的香氣物質(zhì)減少的主要是萜烯類物質(zhì)，增加的主要是醇和酯類物質(zhì)。感官品評(píng)方面，在麥汁煮沸過(guò)程中添加酒花，中國(guó)的Cascade酒花具有突出的柑橘、檸檬、蘋果或桃子的香味；在啤酒儲(chǔ)存期干投Cascade酒花，生成較多的醇類物質(zhì)，酒花的利用率較高。

同樣品種不同國(guó)家種植的酒花，酒花香氣物質(zhì)不完全相同，酒花的香氣物質(zhì)的影響因素很多?？赡芘c年份、地理環(huán)境、土壤條件和氣候環(huán)境等有關(guān)。具體影響酒花香氣物質(zhì)的因素有待進(jìn)一步研究。為酒花香氣物質(zhì)的形成研究提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。