唐開(kāi)永，周鴻翔*，劉彩婷，陳 爍，王曉丹，邱樹(shù)毅，肖甜甜

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550025）

米酒是典型的、以糯米為原料發(fā)酵而成的釀造酒，乙醇和高級(jí)醇是米酒主要的醇類物質(zhì)，其含量直接影響米酒的口感及風(fēng)味。高級(jí)醇主要由正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、β-苯乙醇組成，在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)由糖代謝、氨基酸機(jī)構(gòu)化途徑形成[1]。研究表明[2-4]，適量的高級(jí)醇可以豐富酒的口感及風(fēng)味，但超過(guò)一定濃度時(shí)，酒體變得不協(xié)調(diào)，飲后容易出現(xiàn)頭暈、后苦、上頭等癥狀，長(zhǎng)時(shí)間積累于體內(nèi)而造成機(jī)體損傷[5]，甚至死亡[6]。

目前，發(fā)酵酒中高級(jí)醇的測(cè)定方法有分光光度法、氣相色譜（gas chromatography，GC）法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法。米酒酒精度較低，用國(guó)標(biāo)GB/T 13662—2018《黃酒》中的酒精計(jì)法測(cè)定時(shí)，蒸餾過(guò)程操作繁瑣、浪費(fèi)材料，且誤差大[7]。隨著毛細(xì)管柱的發(fā)展，以其較高的柱效、優(yōu)異的惰性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用[8]。GC對(duì)高級(jí)醇的測(cè)定多采用WAX和FFAP等色譜柱[9]，其研究對(duì)象多為啤酒和白蘭地[10-11]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于發(fā)酵酒中乙醇及高級(jí)醇的分析檢測(cè)研究較多，曾詩(shī)雨等[12]用超純水處理標(biāo)樣采集色譜數(shù)據(jù)建立校正表，固相微萃取-氣相色譜（solid phase microextractiongaschromatography，SPME-GC）法測(cè)定米酒中的乙醇；林玲等[13]采用直接進(jìn)樣，HP-INNOWAX柱測(cè)定黃酒中高級(jí)醇含量；CHUNG H等[14]采用直接進(jìn)樣，CP WAX-57柱測(cè)定韓國(guó)米酒中甲醛、高級(jí)醇含量；盧珍華等[15]采用蒸餾結(jié)合GC的方測(cè)定糯米酒中高級(jí)醇。但目前氣相色譜對(duì)乙醇及高級(jí)醇測(cè)定的研究?jī)H限于成品酒，米酒釀造過(guò)程中的乙醇及高級(jí)醇檢測(cè)鮮有研究。無(wú)論直接進(jìn)樣或蒸餾后超純水定容再進(jìn)樣，都有大量水進(jìn)入色譜柱而造成固定相流失，縮短色譜柱的壽命；對(duì)釀造過(guò)程中乙醇及高級(jí)醇含量測(cè)定方法的研究，有利于及時(shí)把控米酒釀造情況、改善因米酒高級(jí)醇含量高而等實(shí)際生產(chǎn)問(wèn)題。對(duì)于米酒釀造業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

本研究以米酒發(fā)酵酒為對(duì)象，甲醇作為溶劑數(shù)倍稀釋處理，致力于建立米酒釀造過(guò)程中，對(duì)乙醇、丙醇、β-苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇等多種醇同時(shí)測(cè)定的方法，為米酒釀造酒在生產(chǎn)中，對(duì)酒精度及高級(jí)醇含量的控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)把控米酒釀造生產(chǎn)和產(chǎn)品的控制具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

米酒：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 試劑

乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、β-苯乙醇（純度均≥99.95%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純）：臺(tái)灣昌泰有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A型氣相色譜儀（配有7693自動(dòng)進(jìn)樣器、10μL自動(dòng)進(jìn)樣針、HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱）：美國(guó)安捷倫公司；FA1004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

參照《色譜理論基礎(chǔ)》[16]，選用不同極性色譜柱：強(qiáng)極性柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[13]、弱極性柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[17]、中強(qiáng)極性柱DB-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[18]作為乙醇及高級(jí)醇定量分析的目標(biāo)色譜柱。由于溶劑甲醇與乙醇沸點(diǎn)較低且較接近，高級(jí)醇各組分之間的沸點(diǎn)跨度較寬，選擇分流進(jìn)樣、程序升溫的方式采集數(shù)據(jù)，以初始溫度（35℃、40℃、45℃、50 ℃、55 ℃），分流比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）、空氣流量（200 mL/min、250 mL/min、300 mL/min、350 mL/min、400 mL/min）、升溫速率（第一階段（8℃/min、12℃/min、16℃/min、20℃/min）、第二階段（30℃/min、40℃/min、50℃/min、60℃/min））等，以分離度R，保留值（k'）及分析時(shí)間（tm）為分離柱柱效的依據(jù)確定色譜條件。

1.3.2 色譜峰的定性

量取各組分高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)品5 μL、乙醇1 mL分別裝入10 mL容量瓶中，用甲醇定容；得到單一標(biāo)準(zhǔn)液；分別取單一標(biāo)準(zhǔn)液1 mL至10 mL容量瓶混合并用甲醇定容。先用混合溶液進(jìn)樣，分析色譜圖出峰情況，確定色譜柱以及色譜條件；再單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，確定各組分保留時(shí)間。

1.3.3 乙醇及高級(jí)醇的定量

定量方法：外標(biāo)法

取乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、β-苯乙醇，用甲醇定容，配制得到1#～8#梯度濃度6種醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

按照優(yōu)化的色譜條件，標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度由低到高的順序：1#～8#標(biāo)樣依次進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，以各組分標(biāo)樣梯度濃度為橫坐標(biāo)，3次測(cè)定峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，建立校正表，得到各組分的定量線性關(guān)系；將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋濃度進(jìn)樣分析，記錄信噪信號(hào)值，確定各組分的定量限及檢出限。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

（1）重復(fù)性和穩(wěn)定性：取米酒25 mL，用甲醇定容至50 mL，靜置30 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，雙通道同時(shí)進(jìn)樣，每1d測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定5 d，每次重復(fù)3次，每次測(cè)定結(jié)果為3次測(cè)定的峰面積均值，并計(jì)算各組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）精密度：取10 mL實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵米酒加入50 mL容量瓶，用甲醇定容，靜置30 min，過(guò)0.22 μL有機(jī)膜，雙通道同時(shí)進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，外標(biāo)法定量，并計(jì)算各組分的RSD。

（3）準(zhǔn)確度：量取10 mL的米酒發(fā)酵液20份，5份一組（4組），1組用甲醇定容至50 mL，作為本底值，另外3組分別加0.5mL1.3.3中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3#、5#、6#，用甲醇定容為50mL，靜置30min，過(guò)膜，進(jìn)樣分析。計(jì)算各組分的回收率，回收率=（加標(biāo)樣品測(cè)定值-樣品測(cè)定值）/加標(biāo)值×100%[19]。

1.3.5 酒樣的處理及分析

分別量取10mL、5mL、2mL、1mL米酒發(fā)酵液于10mL容量瓶中，用甲醇定容稀釋（1、2、5、10）倍，靜置30 min（沉淀多糖及蛋白質(zhì)等大分子絮狀物），取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化色譜條件

對(duì)三根不同極性色譜柱進(jìn)行柱效分析比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 色譜柱的分離柱效Table 1 Separation column efficiency of chromatographic columns

HP-5色譜柱的氣相色譜圖如圖1所示，甲醇與乙醇的分離度（R）＜1，k'＜0.2（在tm少的同時(shí)，0.2≤k'≤20時(shí)，色譜柱分離度效果越好）[20]，兩者的分離效果不佳，通過(guò)改變色譜條件，也不能改善甲醇與乙醇的分離效果。因此，HP-5色譜柱不適合測(cè)定以甲醇為溶劑的乙醇酒樣。

圖1 HP-5色譜柱測(cè)定酒樣的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of wine sample with HP-5 column

色譜柱DB-FFAP和HP-INNOWAX的標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖見(jiàn)圖2。

由圖2可知，第一個(gè)色譜峰為溶劑甲醇，乙醇及各高級(jí)醇與酒樣譜圖一一對(duì)應(yīng)且彼此分離。由表1和圖2分析優(yōu)化得到本實(shí)驗(yàn)的最佳氣相色譜條件如下：進(jìn)樣量1 μL；分流比為40∶1；進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度250 ℃；氫氣流量30 mL/min；空氣流量300mL/min；分流流量40mL/min；總流量44mL/min；進(jìn)樣器溫度250℃；平均線速度25.812cm/s；柱流量1.0mL/min；程序升溫：初始溫度45℃，保持3min，16℃/min升溫至120℃，保持3 min，以50℃/min升溫至220℃，保持2 min。

圖2 DB-FFAP（A）和HP-INNOWAX（B）色譜柱條件下混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of mixed standards with DB-FFAP(A)and HP-INNOWAX(B)columns

DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱的色譜圖峰形對(duì)稱，各高級(jí)醇組分均能完全分離，甲醇與乙醇峰均有重疊，通過(guò)調(diào)節(jié)分流比、升溫速率、進(jìn)樣量等實(shí)現(xiàn)色譜條件，使得甲醇峰與乙醇峰實(shí)現(xiàn)完全分離；本研究就色譜柱HP-INNOWAX及色譜柱DB-FFAP采用雙通道進(jìn)樣方法做進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.2 組分的定量關(guān)系及檢測(cè)限

雙通道色譜柱同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以信噪比為10（S/N≈10）為定量限濃度，接近信噪比為3（S/N≈3）為檢測(cè)限濃度，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，建立線性方程。得到表2所示的線性范圍、相關(guān)系數(shù)R2、定量限（limit of quantitation，LOQ）及檢出限（limit of detection，LOD）等。

表2 DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱分析各組分的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Linear relation,correlation coefficient,LOD and LOQ of each component analysis by DB-FFAP and HP-INNOWAX chromatographic columns

由表2可知，乙醇含量為0.3%vol～19.2%vol，5種高級(jí)醇的含量為1.2～204.8 mg/L，DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱的峰面積與含量的線性關(guān)系均良好，各組分的相關(guān)系數(shù)R2在0.999 01～0.999 86，R2均＞0.999，定量限范圍分別為0.42～0.056 mg/L和0.028～0.041 mg/L，檢出限范圍分別為0.022～0.039 mg/L和0.010～0.024 mg/L，兩根色譜柱測(cè)定乙醇性能相似，測(cè)定高級(jí)醇時(shí)，HP-INNOWAX色譜柱較DB-FFAP色譜柱的檢出限低。說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，兩根色譜柱在本研究的色譜條件下，6種醇分析檢測(cè)的線性關(guān)系良好。

2.3 方法的重復(fù)性試驗(yàn)

圖3 DB-FFAP（A）和HP-INNOWAX（B）色譜柱分析各組分的重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of reproducibility tests of each component analysis by DB-FFAP(A)and HP-INNOWAX(B)chromatographic columns

采用雙通道DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱對(duì)5倍甲醇處理的發(fā)酵米酒同時(shí)進(jìn)行5次數(shù)據(jù)采集，6種醇的峰面積如圖3所示。

由圖3可知，DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱各組分的峰面積表現(xiàn)平穩(wěn)，沒(méi)有太大差異，且色譜柱DB-FFAP與HP-INNOWAX各組分峰面積的RSD分別在0.1%～1.9%和0.1%～1.5%范圍內(nèi)波動(dòng)，說(shuō)明發(fā)酵酒樣在稀釋5倍時(shí)，DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱的重復(fù)性均良好。

2.4 方法的精密度試驗(yàn)

采用雙通道DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱對(duì)5倍甲醇處理的發(fā)酵米酒，同時(shí)進(jìn)樣分析測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱分析各組分的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests of each component analysis by DB-FFAP and HP-INNOWAX chromatographic columns

由于測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard devi ation，RSD）數(shù)值越低，方法的精密度越高[21]。由表3可知，在測(cè)定稀釋5倍的米酒發(fā)酵液時(shí)，色譜柱HP-INNOWAX各組分的RSD在1.79%～3.39%范圍內(nèi)（＜5%），但DB-FFAP色譜柱除異戊醇的RSD=4.53%外，其他成分的RSD均＞5%，且測(cè)定β-苯乙醇的RSD高達(dá)13.09%。結(jié)果表明，色譜柱HP-INNOWAX測(cè)定稀釋5倍的米酒發(fā)酵液精密度良好。

2.5 方法的加標(biāo)回收率試驗(yàn)

向樣品中加標(biāo)測(cè)定加標(biāo)回收率驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。測(cè)定加入高、中、低3個(gè)水平的回收率及平均回收率，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，6種醇類的平均回收率在90.89%～96.53%范圍內(nèi)，RSD為0.11%～3.02%（＜5%）。結(jié)果表明，此方法檢測(cè)米酒發(fā)酵液中乙醇及高級(jí)醇含量的誤差小，在一定范圍內(nèi)，滿足樣品測(cè)定的要求，表明該方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

表4 HP-INNOWAX色譜柱分析各組分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate tests of each component analysis by HP-INNOWAX chromatographic column

續(xù)表

2.6 米酒樣品中6種醇的測(cè)定

在發(fā)酵前期，發(fā)酵體系含大量水系和有機(jī)大分子，用甲醇作溶劑分別1倍、2倍、5倍、10倍稀釋酒樣，解決因直接進(jìn)樣而導(dǎo)致的進(jìn)樣針推阻和柱流失問(wèn)題色譜柱HP-INNOWAX外標(biāo)定量測(cè)定米酒發(fā)酵液不同倍數(shù)稀釋下各組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同稀釋倍數(shù)米酒乙醇及高級(jí)醇含量測(cè)定結(jié)果及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差Table 5 Determination results and relative standard deviation of ethanol and higher alcohol contents in rice wine with different dilution ratio

由表5可知，與原液酒樣對(duì)比，稀釋2倍～5倍時(shí)RSD值均＜5%，分析結(jié)果與原液測(cè)定值差異不大，但當(dāng)稀釋10倍濃度時(shí)，除異丁醇、異戊醇、己醇RSD＜5%外，其他醇測(cè)定值偏差較大。因此，本方法確定以甲醇稀釋5倍米酒發(fā)酵液為樣品前處理，直接進(jìn)樣分析測(cè)定米酒中乙醇及高級(jí)醇的含量。

3 結(jié)論

本研究以米酒為研究對(duì)象，建立米酒釀造過(guò)程中乙醇及高級(jí)醇含量的測(cè)定方法，通過(guò)優(yōu)化色譜條件，選擇出分離效果較好的色譜柱DB-FFAP和HP-INNOWAX；5倍甲醇稀釋處理，雙通道色譜柱同時(shí)進(jìn)樣分析比較，兩根色譜柱的精密度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：色譜柱DB-FFAP的RSD高達(dá)16%，色譜柱HP-INNOWAX各種醇的RSD均小于5%，表明DB-FFAP色譜柱不適合本方法對(duì)米酒發(fā)酵過(guò)程對(duì)乙醇及高級(jí)醇的測(cè)定；用HP-INNOWAX色譜柱做高、中、低3種不同加標(biāo)濃度的回收率試驗(yàn)，平均回收率為90.89%～96.53%，RSD＜5%。與前人研究方法比較，本研究方法樣品分析時(shí)間短，用時(shí)14.88 min，由此表明，HP-INNOWAX色譜柱的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均良好，并且省時(shí)；綜合考慮進(jìn)樣針及色譜柱等耗材的維護(hù)及損耗，不同倍數(shù)甲醇處理酒樣的色譜分析，確定5倍甲醇稀釋發(fā)酵米酒酒樣。該方法省時(shí)，高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，且實(shí)用性強(qiáng)，可應(yīng)用于米酒釀造工業(yè)生產(chǎn)上對(duì)乙醇及高級(jí)醇的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。