張飛翔，趙珂，高瑞，高慧英，詹軼群，李長燕，楊曉明

1.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；2.軍事醫(yī)學研究院 輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；3.軍事醫(yī)學研究院 生命組學研究所，北京 102206

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是源自肝臟細胞的原發(fā)性惡性腫瘤，在常見腫瘤類型中位居第六。全球每年約有630 000 例HCC 新增病例，占所有新發(fā)腫瘤病例的5.7%，80%的患者分布在發(fā)展中國家，我國獨占55%[1-2]。誘發(fā)HCC的因素較多，主要包括乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、酗酒、肥胖及2 型糖尿病[3]。該病早期診斷性差，生存期短，臨床反應性低，使得它具有高度的致命性。HCC 患者在早期診斷中可以通過手術(shù)切除、肝臟移植和局部區(qū)域治療的方式提高生存期[4]，但總體生存率仍然不會超過10%[5]，大多數(shù)晚期患者的治療方法也十分有限。目前最有效的晚期HCC 靶向治療藥物索拉非尼僅將生存期從7.9 個月提高到10.7 個月[6]。因此，迫切需要開發(fā)更新、更有效的治療HCC的藥物。

活體熒光成像是一種光學分子成像技術(shù)，利用螢光素酶基因標記細胞，加入螢光素酶底物后可產(chǎn)生熒光，通過高靈敏度光學檢測儀器對活體生物體內(nèi)細胞行為實現(xiàn)可視化、實時動態(tài)監(jiān)測及定量分析[7]。該技術(shù)主要用于臨床前研究，可用于監(jiān)測細胞內(nèi)基因表達[8]、活體動物模型中病原體和腫瘤的定位及追蹤[9-10]、細胞增殖和遷移等。目前，含有螢光素酶基因標簽的腫瘤模型得到了廣泛應用，該模型能快速、無創(chuàng)、可視化地觀察體內(nèi)腫瘤生長變化，并提供腫瘤生長的定量信息，是腫瘤發(fā)病機制研究和抗腫瘤藥物研發(fā)的重要模型。為建立一種可以實時、定量、動態(tài)檢測的肝細胞癌原位移植模型，我們采用慢病毒感染的方式建立能夠穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白（green fluo?rescent protein，GFP）和螢火蟲螢光素酶（lucifer?ase，Luc）基因的肝癌細胞系HepG2，進而建立表達雙熒光的肝癌原位移植模型，為抗腫瘤藥物研發(fā)和藥效評價提供重要的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c-nu/nu 裸鼠，雄性，4～5 周齡，體重 20～22 g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司；肝癌細胞HepG2、人胚腎細胞293T、慢病毒過表達載體 pCDH-GFP-luc（此載體含有 GFP、Luc 和嘌呤霉素基因）、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2G 為本實驗室保存；大腸桿菌DH5α購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

甲苯磺酸索拉非尼片購自Bayer 公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自國藥集團化學試劑有限公司；EndoFree 質(zhì)粒 DNA 純化試劑盒 Maxi（10）購自Qiagen 公司；細胞培養(yǎng)基DMEM 購自Gibco公司，jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Polyplus-transfec?tion 公司；胎牛血清購自Gemini 公司；超濾管購自Millipore公司 ；Xenolight D-Luciferin Potassium Salt購自Perkin Elmer公司；Dual-Luciferase Re?porter Assay System 試劑盒購自 Promega 公司；倒置熒光顯微鏡購自Olympus 公司；流式細胞儀購自 BD 公司；IVSI LuminaⅡ成像儀購自Perkin El?mer 公司。

1.2 質(zhì)粒大提與慢病毒包裝

分別將上述3 種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)擴增后采用EndoFree 質(zhì)粒DNA 純化試劑盒Maxi（10）進行質(zhì)粒大提。

用含10%胎牛血清的H-DMED 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T 細胞，轉(zhuǎn)染前24 h 將細胞鋪于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，細胞密度達80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。將3 μg pMD2G、9 μg pSPAX2、12 μg pCDH-GFPLuc 加入 500 μL jetPRIME 緩沖液中渦旋混勻，再加入48 μL jetPRIME 試劑，渦旋混勻后室溫靜置10 min；將混合物逐滴加到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染 4～6 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中加15 mL，24 h 后補加 15 mL 培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染 48 和 72 h 分別將上清液收集于50 mL 離心管中，4℃、3000 r/min離心15 min 去除細胞碎片；用超濾管濃縮，4℃、4500 r/min 離心 30 min，濃縮液過 0.45 μm 濾膜，向收集到的濾液中各加1/5 體積的5×PEG，4℃靜置過夜；4℃、1500 r/min 離心30 min，棄上清，用SFEM 培養(yǎng)基溶解病毒沉淀，分裝后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 慢病毒滴度檢測

按每孔 2×105/500 μL的密度將 293T 細胞接種到24 孔板內(nèi)，24 h 后分別加入不同濃度病毒感染細胞，感染24 h 后更換培養(yǎng)基，48 h 后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達。收集細胞，通過流式細胞儀檢測GFP 陽性率并計算病毒滴度（病毒滴度=陽性細胞百分率×接種細胞數(shù)/加入病毒體積）。

1.4 HepG2-GFP-Luc細胞系的建立

將肝癌細胞HepG2 接種于6 孔板中，待細胞處于對數(shù)生長期時按MOI=10 加入帶有GFP 標簽、嘌呤霉素抗性標簽及Luc 基因的慢病毒，培養(yǎng)12 h 后進行第2 次感染。細胞感染48 h 后，用熒光顯微鏡觀察細胞中是否表達GFP。更換含有5 μg/mL 嘌呤霉素的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞12 h，用普通顯微鏡觀察細胞存活情況并檢測GFP 陽性率。流式細胞儀分選GFP+細胞并擴增培養(yǎng)。

1.5 螢火蟲螢光素酶表達鑒定

將上述細胞接種于24 孔板內(nèi)，待細胞融合至90%左右時，棄上清，用PBS 清洗2 次，每孔加入被動裂解液100 μL，充分振蕩30 min 裂解細胞，每孔吸取 30 μL 上清裂解液，加入 30 μL Lucif?eras Assay ReagentⅡ液充分混合，立即放入發(fā)光儀，測量室內(nèi)測定Luc 活性。另將不同密度的細胞懸液接種于96 孔板內(nèi)，待細胞貼壁后棄上清，用PBS 清洗2 次，加入100 μL 底物（濃度150 μg/mL），用IVSI LuminaⅡ成像儀體外檢測自發(fā)熒光強度。

1.6 皮下腫瘤模型的建立

體外擴增培養(yǎng)表達螢光素酶的HepG2 細胞，收集細胞，用 PBS 重懸，制備 2.5×107/mL 細胞懸液，并按照每只200 μL 注射于4～5 周齡裸鼠右側(cè)前肢腋窩皮下，2 周后用IVSI LuminaⅡ成像儀進行活體成像。

1.7 肝癌原位移植模型的建立及分組給藥

待異體腫瘤組織長至直徑1 cm 左右時取出，除去外層包膜和內(nèi)部壞死部分，選取中間魚肉狀腫瘤組織，放入生理鹽水中，切成1 mm3左右的瘤塊備用。將體重20～22 g的20 只裸鼠用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，固定，碘伏棉球消毒腹部皮膚，自胸骨下方沿著腹中線向下剪開約1 cm 切口，擠出肝臟，將瘤塊置于20 號穿刺針頭內(nèi)并接種于肝左葉，用無菌棉棒充分按壓止血后將肝臟塞入腹腔，傷口滴加少量注射用青霉素鈉溶液后，用無菌針線依次縫合肌肉層和皮膚，術(shù)后第10 d 對裸鼠進行活體成像。將造模成功的裸鼠按照發(fā)光部位的熒光總光子數(shù)值大小隨機分為對照組和治療組，分別給與0.5%羧甲基纖維素鈉溶液和50 mg/kg 索拉非尼溶液，灌胃給藥2/d，連續(xù)給藥28 d，每7 d 進行一次活體成像，觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤動態(tài)變化。結(jié)束實驗后，處死全部裸鼠，解剖裸鼠肝臟，分離瘤塊并拍照稱重。

1.8 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 5 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異采用t檢驗，P＜0.05 認為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 pCDH-GFP-Luc慢病毒的包裝及滴度測定

將 pCDH-GFP-luc、psPAX2 和 pMD2G 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞，48 h 后熒光顯微鏡觀察到約80%的細胞表達GFP（圖1A）。收集病毒后濃縮并沉淀，用SFEM 培養(yǎng)基溶解病毒沉淀，然后測定病毒滴度。結(jié)果如圖1B、C，加入體積為0.5 μL的病毒48 h 后，熒光顯微鏡觀察到細胞具有綠色熒光，流式細胞儀檢測GFP+細胞的比率為30.2%，經(jīng)計算病毒滴度為1.21×108pfu/mL，該滴度完全可用于后續(xù)研究。

2.2 HepG2-GFP-Luc細胞系的建立及鑒定

向 HepG2 細胞中加入 50 μL 慢病毒，12 h 后進行第2 次感染，48 h 后在熒光顯微鏡下可以觀察到成功感染的細胞產(chǎn)生綠色熒光（圖2A）。用5 mg/mL 嘌呤霉素篩選12 h 后，細胞經(jīng)流式細胞儀檢測到GFP 陽性率為99%（圖2B），體外培養(yǎng)2周后GFP 陽性率為98.9%（圖2C），提示外源基因成功整合到HepG2 細胞染色體上并穩(wěn)定遺傳表達。對GFP+細胞進行流式細胞儀分選，獲得穩(wěn)定表達 GFP 和 Luc的 HepG2 細胞株 HepG2-GFPLuc。

圖1 慢病毒包裝及病毒滴度檢測

圖2 慢病毒感染HepG2細胞

對獲得的HepG2-GFP-Luc 細胞中的Luc 活性進行測定，結(jié)果如圖3A，HepG2-GFP-Luc 細胞Luc 活性達106，遠遠高于對照組未感染病毒的HepG2 細胞（Luc 活性為 103），證明肝癌細胞株HepG2-GFP-Luc 高表達 Luc（n=3）。利用不同數(shù)量的HepG2-GFP-Luc 細胞進行體外自發(fā)熒光強度檢測，結(jié)果表明，細胞體外成像發(fā)光信號強度與細胞數(shù)目存在線性相關(guān)關(guān)系（圖3B、C）。

2.3 HepG2-GFP-Luc皮下成瘤活體成像

向裸鼠皮下注射5×106細胞，2 周后長出肉眼可見的腫瘤組織塊，通過IVIS 成像儀器對裸鼠皮下瘤組織進行活體成像，結(jié)果如圖4。裸鼠皮下瘤組織表達Luc，成瘤率為100%（n=4），生物發(fā)光總光子數(shù)為 1.453×108～7.113×108p/s。該成瘤組織可用于原位移植模型的建立。

2.4 HepG2-GFP-Luc肝細胞癌原位移植模型活體成像及動態(tài)觀察

分離皮下成瘤組織，接種肝臟原位，術(shù)后第10 d 對裸鼠進行活體成像，顯示腫瘤組織在肝臟內(nèi)成功存活，造模成功率為90%（18/20），檢測到65%的裸鼠體內(nèi)熒光信號為 4.10×106～9.24×106p/s，由于儀器靈敏度有限，25%的裸鼠體內(nèi)熒光信號可以檢測，但無法得到精確數(shù)值（圖5）。

將造模成功的裸鼠分為對照組（n=6）和治療組（n=7），在第10、17、24、31、38 d 對裸鼠活體成像，結(jié)果顯示對照組裸鼠肝臟腫瘤細胞隨時間延長而增殖，熒光信號強度也隨之增加；而由于藥物的作用，索拉非尼治療組腫瘤細胞增殖相比于對照組受到抑制，熒光信號強度明顯弱于對照組（圖6）。以每次活體成像得到的熒光總光子數(shù)值繪圖，得到熒光總光子數(shù)-時間曲線圖（圖7），可以看出對照組總光子數(shù)值隨時間的推移而逐漸增長，第31 d 起明顯增加；而索拉非尼治療組腫瘤細胞增殖受到抑制，總光子數(shù)值增長緩慢。與對照組相比，第24、31 和38 d 治療組裸鼠總光子數(shù)值顯著低于對照組,這與圖6中熒光信號強度相符。另外，從各組裸鼠解剖后獲得的腫瘤總覽圖中可以看出索拉非尼治療組腫瘤體積明顯小于對照組（圖8），而對各組腫瘤重量的統(tǒng)計結(jié)果表明，治療組平均瘤重顯著低于對照組（圖9）。以上結(jié)果說明建立了HepG2-GFP-Luc 肝細胞癌原位移植裸鼠模型，活體成像系統(tǒng)檢測的腫瘤細胞熒光信號強度能夠反映裸鼠肝臟內(nèi)腫瘤大小變化，并且通過對比治療組和對照組活體成像結(jié)果證明該模型可用于抗肝癌藥物的研發(fā)及藥效評價。

圖3 檢測HepG2細胞中Luc的表達

圖4 接種2周后裸鼠皮下腫瘤組織活體成像

圖5 活體熒光成像檢測裸鼠肝細胞癌原位移植模型

圖6 裸鼠肝細胞癌原位移植模型不同時間點活體成像檢測

圖7 熒光總光子數(shù)-時間曲線圖

圖8 處死裸鼠后解剖分離獲得的瘤塊

圖9 各組裸鼠肝臟腫瘤重量統(tǒng)計

3 討論

隨著對腫瘤研究的不斷深入，傳統(tǒng)的動物腫瘤模型在腫瘤學研究中受到諸多限制。尤其是原位腫瘤模型實驗，要獲得特定時間點的腫瘤生長信息必須處死動物，這對動態(tài)監(jiān)測腫瘤生長非常不便。肝癌原位移植模型在腫瘤微環(huán)境、形態(tài)、轉(zhuǎn)移性及對藥物的反應性等方面能夠很好地模擬人肝癌發(fā)生的情況。但由于其腫瘤病灶發(fā)生在肝臟，導致無法有效地對動物體內(nèi)腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移情況進行直接觀察及動態(tài)監(jiān)測。因此，實時、可視化并且可進行動態(tài)定量分析的肝癌原位模型的建立非常重要。

近年來，由于活體生物發(fā)光成像具有高靈敏度、非損傷性、低成本和功能多樣性的優(yōu)點，在小動物模型中的應用迅速增長[11]。經(jīng)過螢光素酶基因修飾后的細胞可以表達螢光素酶，當給予螢光素酶底物時，此酶在O2、ATP 及Mg2+存在的條件下催化底物熒光素氧化并發(fā)光[12-13]。螢光素酶標記的原位腫瘤模型正是利用這一原理實現(xiàn)對動物體內(nèi)腫瘤大小和轉(zhuǎn)移進行實時觀察。與傳統(tǒng)模型相比，不僅操作簡單，節(jié)省了人力物力，還能降低實驗成本，可在多個時間點獲得相關(guān)數(shù)據(jù)信息，這也是此模型能夠在腫瘤研究中廣泛應用的重要原因。但是，螢光素酶催化的發(fā)光是化學發(fā)光，其標記的細胞無法在顯微鏡下進行觀察，使得在建立穩(wěn)定表達細胞株時無法進行有效的篩選。因此，引入綠色熒光蛋白標簽對于目的細胞的篩選與純化具有非常重要的作用。本研究采用雙熒光標記方法，將GFP 與Luc 基因構(gòu)建到同一種載體上，可使目的細胞同時表達2 種熒光，不僅實現(xiàn)了穩(wěn)定表達細胞株的篩選與純化，還能在體內(nèi)通過加入底物的方法實時、動態(tài)檢測腫瘤細胞的生長增殖。

建立熒光標記的腫瘤模型關(guān)鍵在于獲得穩(wěn)定遺傳并表達熒光的細胞株，慢病毒感染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是最常用的2 種方法。慢病毒載體是在人免疫缺陷病毒（HIV-1）基礎上發(fā)展而來，是一種屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA 病毒。它能在病毒自身的反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的作用下將插入的外源基因片段整合到宿主細胞染色體上，感染宿主細胞范圍廣，感染效率高，并且能長期穩(wěn)定地遺傳和表達[14-15]。而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是通過細胞膜融合和胞飲作用將人工脂質(zhì)體內(nèi)的質(zhì)粒導入細胞的一種方法，載體DNA 隨機整合，效率低且具有細胞毒性，轉(zhuǎn)染后獲得單克隆細胞時間也較長。本研究采用的慢病毒載體是pCDH-GFP-Luc，該載體攜帶GFP、Luc 和嘌呤霉素基因作為生物標記，能夠?qū)崿F(xiàn)宿主細胞被3 種標簽基因同時標記。對慢病毒感染的HepG2 細胞首先進行嘌呤霉素的篩選，可使GFP 陽性細胞達到99%左右，進一步利用流式細胞術(shù)篩選，獲得高度純化的pCDH-GFPLuc 穩(wěn)定表達細胞株。

本研究利用第二代慢病毒感染的方式，構(gòu)建了穩(wěn)定表達雙熒光（GFP 和Luc）的肝癌細胞系HepG2-GFP-Luc，再通過皮下-原位間接移植方法建立了裸鼠肝細胞癌原位移植模型，并對比對照組和治療組活體熒光成像結(jié)果，證明可以通過活體熒光成像技術(shù)在不同時間對該模型裸鼠體內(nèi)肝細胞癌的生長變化直接觀察、記錄，發(fā)光信號強弱能夠反映體內(nèi)腫瘤大小變化，進而實現(xiàn)了對腫瘤生長過程的動態(tài)定量分析，為抗肝癌藥物研發(fā)和藥效評價提供了重要的科學工具。