李向陽，田青，董峰

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

隨著工業(yè)化的發(fā)展，重金屬污染問題日益突出，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到動物和人類的健康。其中，重金屬鎘（cadmium，Cd）伴隨著采礦、冶金和電池制造等行業(yè)產(chǎn)生的廢水、廢氣和廢渣釋放到環(huán)境中[1]，并通過生物富集和食物鏈進入動物和人類機體，造成胎盤、睪丸、腎、肝、肺、大腦和心臟等多個組織和器官損傷[2-5]。更重要的是，Cd 在動物和人類機體內(nèi)不易排出，半衰期長達10～30年，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用[6]。

胎盤是哺乳動物妊娠過程中的臨時性器官，其主要作用是為胎兒傳遞營養(yǎng)物質(zhì)、運輸代謝產(chǎn)物和分泌激素[7-9]。胎盤的正常發(fā)育主要取決于滋養(yǎng)層細胞增殖和分化的正常進行[10]。胎盤的功能受損可能會引起先兆子癇、胎兒發(fā)育遲緩甚至流產(chǎn)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)胎盤對重金屬Cd 具有一定的屏障作用，蓄積在母體胎盤中的Cd，只有極小的部分會穿過胎盤直接作用于胎兒[13]。Cd 可以引起小鼠滋養(yǎng)層細胞腫脹變形和空泡化，抑制細胞的增殖并增加其凋亡率，造成胎盤萎縮[14]。Cd 可以誘導(dǎo)胎盤JEG-3 細胞產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起胎盤內(nèi)氧化與抗氧化失衡，阻礙胎盤的正常發(fā)育[15]。這提示我們，Cd可能通過增加胎盤內(nèi)ROS，降低胎盤內(nèi)抗氧化酶活性，進而影響胎盤的正常功能。因此，我們以HTR-8/SVneo 細胞為研究對象，檢測Cd 對HTR-8/SVneo 細胞活性、形態(tài)、ROS 水平、抗氧化酶活性和丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量的影響，為研究Cd的胎盤毒性提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

胎盤絨毛外滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo 細胞購于ATCC，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

RPMI1640 培養(yǎng)基購于Gibco 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；氯化鎘（CdCl2）購于Sigma公司；CCK-8 試劑盒購于博士德公司；ROS 檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）試劑盒和MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他各類試劑均為分析純試劑。

1.2 CCK-8檢測細胞活性

收集對數(shù)生長期細胞，96 孔板內(nèi)每孔接種1.0×104細胞，設(shè)置對照組和CdCl2處理組，每組設(shè)3 個重復(fù)孔。待細胞密度達60%左右時，加入不同濃度（0、3、6、12 μmol/L）CdCl2處理細胞24 h，或者用12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；處理結(jié)束后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測D450nm值，計算細胞存活率。

1.3 顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化

收集對數(shù)生長期細胞，96 孔板內(nèi)每孔接種1.0×104細胞，設(shè)置對照組和 CdCl2處理組、CdCl2與N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）共處理組，每組3 個重復(fù)孔。待細胞密度達60%左右時，用12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；CdCl2與NAC 共處理組先用500 μmol/L NAC 預(yù)處理細胞2 h，然后加入 12 μmol/L CdCl2與 500 μmol/L NAC 共同處理細胞24 h。處理結(jié)束后，PBS 清洗細胞1 次，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.4 ROS含量檢測

收集對數(shù)生長期細胞，6 孔板內(nèi)每孔接種3.0×105細胞，設(shè)置對照組和 CdCl2處理組、CdCl2與NAC 共處理組，待細胞密度達到60%左右時，用12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；CdCl2與 NAC 共處理組先用 500 μmol/L NAC 預(yù)處理細胞 2 h，然后加入 12 μmol/L CdCl2與 500 μmol/L NAC 共同處理細胞24 h。處理結(jié)束后，PBS 清洗細胞 1 次，各孔加入 1 mL DCFH-DA 探針溶液（用無血清 RPMI1640 培養(yǎng)基 1∶1000 稀釋），避光孵育30 min，收集細胞，用流式儀檢測細胞內(nèi)ROS 含量變化。

1.5 SOD、CAT、GPx活性及MDA含量檢測

收集對數(shù)生長期細胞，每個10 cm 培養(yǎng)皿內(nèi)接種2.0×106細胞，設(shè)置對照組和CdCl2處理組、CdCl2與NAC 共處理組。待細胞密度達60%左右時，用 12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；CdCl2與 NAC 共處理組先用 500 μmol/L NAC 預(yù)處理細胞2 h，然后加入12 μmol/L CdCl2與500 μmol/L NAC 共同處理細胞24 h。處理結(jié)束后收集細胞，于冰上勻漿破碎細胞，12 000 r/min 離心10 min，上清液即為細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒說明檢測細胞內(nèi)SOD、CAT、GPx 活性和MDA 含量變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，實驗結(jié)果以mean±SEM 表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 CdCl2抑制HTR-8/SVneo細胞活性

如圖1所示，HTR-8/SVneo 細胞經(jīng) 0、3、6、12 μmol/L CdCl2處理 24 h，或經(jīng) 12 μmol/L CdCl2分別處理 0、6、12、24 h 后，細胞活性隨CdCl2濃度的增大或處理時間的延長而逐漸降低（P＜0.01），呈濃度和時間依賴性。

2.2 CdCl2引起HTR-8/SVneo細胞形態(tài)損傷

CCK-8 結(jié)果顯示 CdCl2引起 HTR-8/Svneo 活性下降，本研究后續(xù)實驗采用時間依賴模型探究CdCl2引起細胞毒性損傷的機制。如圖2所示，對照組細胞呈典型的鋪路石狀；隨著CdCl2處理時間的延長，細胞數(shù)量逐漸減少，細胞之間的間隙逐漸增大，并發(fā)生皺縮、變圓，有的細胞甚至脫落。經(jīng)500 μmol/L NAC 與12 μmol/L CdCl2共同處理24 h 后，細胞皺縮、變圓現(xiàn)象減少，說明NAC 明顯緩解了Cd 引起的HTR-8/SVneo 細胞形態(tài)損傷。

2.3 CdCl2激發(fā)HTR-8/SVneo細胞內(nèi)ROS升高

圖1 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞活性的影響

圖2 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞形態(tài)的影響

12 μmol/L CdCl2分別處理HTR-8/SVneo 細胞0、6、12、24 h 后，用 DCFH-DA 標(biāo)記細胞，通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS 含量，結(jié)果見圖3。隨著處理時間的延長，細胞內(nèi)ROS 含量逐漸升高。與對照組相比，12 μmol/L CdCl2處理 HTR-8/SV?neo 細胞 12 h 時，ROS 含量顯著升高，約為對照組的 2.30 倍（P＜0.05）；處理時間達24 h 時，升高至對照的 2.97 倍。用 500 μmol/L NAC 與 12 μmol/L CdCl2共處理，發(fā)現(xiàn) NAC 可 以有效抑制 CdCl2引起的HTR-8/SVneo 細胞內(nèi)ROS 含量升高。

2.4 CdCl2造成HTR-8/SVneo細胞內(nèi)抗氧化酶的活性降低

與對照組相比，經(jīng)12 μmol/L CdCl2處理后，HTR-8/SVneo 細胞內(nèi) CAT、GPx 和 SOD 活性呈時間依賴性降低，在處理12 h 時CAT 活性開始出現(xiàn)顯著性降低（圖4A，P＜0.05），處理 24 h 時 SOD 和GPx 活性顯著降低（圖4B、C，P＜0.05，P＜0.01）。用500 μmol/L NAC 與 12 μmol/L CdCl2共處理，發(fā)現(xiàn)NAC 可以有效緩解CdCl2引起的HTR-8/SVneo細胞內(nèi)抗氧化酶活性的降低。

2.5 CdCl2引起HTR-8/SVneo細胞脂質(zhì)過氧化

如圖4D所示，經(jīng) 12 μmol/L CdCl2處理后，細胞內(nèi)的MDA 含量逐漸增加，處理12 h 時MDA 含量顯著性升高（P＜0.05），處理 24 h 時 MDA 含量與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），升高至對照組的 3.11 倍，說明 CdCl2引起了 HTR-8/SVneo 細胞脂質(zhì)過氧化損傷。用500 μmol/L NAC 與12 μmol/L CdCl2共處理，NAC 可以有效抑制 CdCl2引起的HTR-8/SVneo 細胞脂質(zhì)過氧化。

3 討論

環(huán)境中的Cd 可通過多種途徑如攝食、飲水和呼吸進入人體，對多個器官和組織造成損傷[2-5]。在妊娠期時，Cd 更易在胎盤中蓄積，并隨著妊娠期的延長而蓄積量明顯增加[16]。Cd 在胎盤中的蓄積，使得胎盤極易發(fā)生毒性損傷，已有研究表明Cd 能引起胎盤功能受損，并導(dǎo)致先兆子癇、胎兒發(fā)育遲緩甚至流產(chǎn)[14]。

圖3 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)ROS含量的影響

圖4 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)CAT（A）、GPx（B）、SOD（C）和MDA（D）的影響（*P＜0.05，#P＜0.05，**P＜0.01，##P＜0.01）

許多研究表明Cd 可以引起胎盤、腎臟、肝臟和大腦等多個器官和組織ROS 水平升高，引發(fā)氧化損傷[14,17-18]。汪紀(jì)倉等證實醋酸鎘（CdAc2）能誘導(dǎo)大鼠肝臟細胞ROS 水平升高和形態(tài)變化，并且經(jīng)抗氧化劑NAC 處理后，細胞的皺縮變圓現(xiàn)象明顯減少[19]。本研究發(fā)現(xiàn)CdCl2能夠造成絨毛外滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo 細胞活性下降和形態(tài)學(xué)損傷，激發(fā) HTR-8/SVneo 細胞內(nèi) ROS 生成；并且，ROS 清除劑NAC 與CdCl2共處理，顯著抑制了CdCl2引起的HTR-8/SVneo 細胞形態(tài)損傷和活性下降。以上結(jié)果說明Cd 引起的HTR-8/SVneo 細胞活性下降和形態(tài)變化與Cd 激發(fā)的細胞內(nèi)ROS 升高有關(guān)。

當(dāng)細胞發(fā)生ROS 升高時會啟動自身的抗氧化系統(tǒng)，包括多種抗氧化酶如SOD、CAT、GPx[20]，以及谷胱甘肽（GSH）、褪黑素、維生素C、維生素E[21-24]等。SOD 可以清除細胞內(nèi)過多的超氧陰離子自由基，CAT 可以清除細胞內(nèi)的H2O2[20]。GPx 可以催化細胞內(nèi)天然抗氧化物GSH 轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而達到清除多種自由基的作用[25]。體外實驗發(fā)現(xiàn)Cd 可以引起A549 細胞內(nèi)ROS 含量升高，并造成脂質(zhì)過氧化損傷，最終耗竭細胞內(nèi)的 SOD 和 GPx[26]；Cd 也可以降低 HepG2細胞內(nèi)CAT的活性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著CdCl2處理時間的延長，SOD、CAT、GPx的活性逐漸降低，可能是細胞內(nèi)抗氧化酶在發(fā)揮清除ROS 作用時逐漸被消耗。CdCl2處理HTR-8/SVneo 細胞，引起CAT 活性在12 h 時開始出現(xiàn)顯著性降低，而SOD和GPx 活性則在24 h 時出現(xiàn)顯著性差異，其原因可能是在HTR-8/SVneo 細胞內(nèi)，各種抗氧化酶的含量及其開始發(fā)揮清除自由基作用的時間上存在差異。MDA 是細胞受到脂質(zhì)過氧化損傷時的標(biāo)志分子[28]。在本研究中CdCl2處理12 h 時，HTR-8/SVneo 細胞內(nèi)MDA 含量開始出現(xiàn)顯著性升高，說明Cd 能夠?qū)е翲TR-8/SVneo 細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化。

以上結(jié)果證實Cd 引起HTR-8/SVneo 細胞內(nèi)ROS 含量增加，消耗細胞內(nèi)的 SOD、CAT、GPx 等抗氧化酶，并引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，NAC 則可以有效緩解Cd 引起的細胞內(nèi)ROS 升高與抗氧化酶活性降低。本研究為闡明Cd的胎盤毒性機制提供了基礎(chǔ)，為篩選治療Cd 致胎盤毒性損傷的藥物提供了思路。