徐 霞,王鵬程,韓 璐

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院蘇州九龍醫(yī)院,江蘇 蘇州 215000)

人類胎盤的侵襲性絨毛外滋養(yǎng)層與成功的妊娠結(jié)局密切相關(guān)。它們重塑子宮螺旋動(dòng)脈,以增加流向胎盤和發(fā)育中胎兒的血流和氧氣輸送[1-2]。滋養(yǎng)層細(xì)胞系的細(xì)胞活動(dòng),如滋養(yǎng)層的增殖、分化、遷移和侵襲,是健康妊娠的關(guān)鍵。由于滋養(yǎng)層侵襲與螺旋動(dòng)脈重塑相關(guān),甚至是其關(guān)鍵,而螺旋動(dòng)脈重塑是成功胎盤形成的先決條件[3]。與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)的一些特征已被證實(shí),波形蛋白和N-鈣黏蛋白作為間充質(zhì)細(xì)胞的強(qiáng)制性標(biāo)記,迄今為止尚未在EVT亞群中報(bào)道[4]。此外,據(jù)報(bào)道,兩種非經(jīng)典鈣黏蛋白,血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)和鈣黏蛋白-11(CDH-11)在人類胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)。CDH-11和VE-cadherin被描述為ST和EVT的特征。已有研究表明,幾種miRNA通過靶向不同的基因?qū)TR-8/SVneo細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,如靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的miR-30a-3p[4]、靶向肝細(xì)胞受體B4(EPHB4)[5]的miR-454,miR-320a靶向肝臟雌激素相關(guān)受體γ(ERRγ)[6],miR-423-5p靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子2mRNA結(jié)合蛋白1(IGF2BP1)[7],微小RNA-184(miR-184)靶向趨化因子12(CXCL12β)[8],miR-184靶向野生型p53誘導(dǎo)基因1(WIG1)[9]miR-210靶向Notch跨膜受體-1(NOTCH1)[10]。原位雜交顯示,滋養(yǎng)層在胎盤中表達(dá)miR-184[11],而唐氏綜合征胎兒胎盤中miR-184的表達(dá)上調(diào)[12]。在早發(fā)性重度子癇前期,miR-184通過靶向鞘氨醇1磷酸酯裂解酶1(SGPL1)增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生(IL-8)[13]。然而,miR-184在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的功能仍不清楚[14]。本文進(jìn)一步從女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中miR-184表達(dá)水平、外源性miR-184表達(dá)水平,以及miR-184對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響進(jìn)行研究,以全面掌握miR-184在女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑:HTR8/SVneo、Swan71和正常的上皮組織細(xì)胞,胎牛血清,頭孢噻嗪(HT),300 μg/ml,100 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5 mol/L EDTA緩沖液,堿性裂解液:0.2 mol/L NaOH,1% SDS乙酸鈉:3 mol/L KAc(pH 4.8);異丙醇70%乙醇;溴酚藍(lán),蔗糖指示劑。 TBE緩沖液,1%瓊脂糖,溴化乙錠。 PI母液:500 μg/ml; Ho33342母液:2 mmol/L。

1.1.2 儀器和設(shè)備:熒光顯微鏡,電泳儀,電泳槽,微量取樣器(1 ml,100 μl)0.5、1.5 ml離心管,載玻片,蓋玻片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 ①使用DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(10%)、制作細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行樣本細(xì)胞培養(yǎng)。②在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素,將采集的女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織樣本細(xì)胞在37 ℃和5%的CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。③將si-miR-184轉(zhuǎn)染到女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織腺細(xì)胞HTR8/SVneo、Swan71中,完成轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置空白載體和陰性對(duì)照組(Si-NC)一起進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)周期為2 d。④提取PCR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以Primescript和SYBR primixextaq試劑作為轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)錄效率檢測(cè),對(duì)其轉(zhuǎn)染率進(jìn)行定量的檢測(cè)和數(shù)據(jù)記錄。

2 結(jié) 果

2.1 女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中miR-184表達(dá)水平 在HTR8/SVneo細(xì)胞、Swan71細(xì)胞及正常細(xì)胞中miR-184表達(dá)水平依次為3.27±0.51、1.57±0.22、1.00±0.23,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織細(xì)胞中外源性miR-184表達(dá)水平 見圖1。從結(jié)果可以看出,在正常上皮細(xì)胞中miR-184在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞表達(dá)水平要比轉(zhuǎn)染前低,而在女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織miR-184的表達(dá)水平比轉(zhuǎn)染前的要高。并且從其相對(duì)表達(dá)量的直方圖來看,相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的差異,在miR-184組中表現(xiàn)更為明顯。經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平比在轉(zhuǎn)染之前更低(均P<0.05)。經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染pcDNA3．1-miR-184后,miR-184在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平比轉(zhuǎn)染之前更高(均P<0.05)。

A為上皮組織細(xì)胞組織;B為女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中miR-184的表達(dá)

2.3 miR-184表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖的作用 si-miR-184促使miR-184的表達(dá)能夠抑制HTR8/SVneo和Swan71細(xì)胞的增殖。在HTR8/SVneo細(xì)胞中,各時(shí)間段si-miR-184的吸光值與si-NC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),在A549細(xì)胞中,各時(shí)間段si-miR-184的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-184表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖的作用

2.4 miR-184表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡的作用 利用si-miR-184的轉(zhuǎn)染降低miR-184的表達(dá)水平能夠阻礙女性滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡作用(P<0.01),而miR-184的過度表達(dá)能夠明顯推動(dòng)女性滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡作用(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-184表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

女性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡是胎盤發(fā)育過程中發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡,其潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制負(fù)責(zé)胎盤的穩(wěn)態(tài)。這些凋亡過程的改變可導(dǎo)致胎盤功能障礙,并導(dǎo)致各種病理狀況。miRNA是破壞mRNA和(或)誘導(dǎo)翻譯抑制的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,其在胎盤形成過程中調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用[15]。然而,在女性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡過程中,miRNA參與的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-184通過靶向髓細(xì)胞白血病基因1(MCL1)在調(diào)節(jié)HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡中起作用。越來越多的證據(jù)表明,miR-184在誘導(dǎo)多種細(xì)胞(主要是免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)凋亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。已有研究分析了miR-184在HTR-8/SVneo細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡,這表現(xiàn)出滋養(yǎng)層細(xì)胞的特征,滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)miR-184,在所謂的胎盤中觀察到特別強(qiáng)烈的表達(dá),但在胎盤中被IUGR下調(diào)。已有研究結(jié)果表明,miR-125可能參與正常胎盤形成和妊娠相關(guān)并發(fā)癥,這些并發(fā)癥通過誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡而發(fā)生。

本文利用定量的反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中miR-184的表達(dá),通過測(cè)定miR-184在HTR8/SVneo和Swan71兩種細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平作為女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中miR-184表達(dá)水平[17]。測(cè)定經(jīng)2 d培養(yǎng)周期的轉(zhuǎn)染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平作為女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織細(xì)胞中外源性miR-184表達(dá)水平。在HTR8/SVneo細(xì)胞中對(duì)各時(shí)間段si-miR-184的吸光值與si-NC差異分析miR-184表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖的作用,最后通過si-miR-184的轉(zhuǎn)染方式降低miR-184的表達(dá)水平觀察對(duì)女性滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡影響[18]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,miR-184在HTR8/SVneo和Swan71兩種細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平比在正常的上皮組織細(xì)胞中更高;在A549細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平比在正常的上皮組織細(xì)胞中更低;經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平比在轉(zhuǎn)染之前更低。同時(shí)通過細(xì)胞增殖對(duì)比實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.1的miR-184后,miR-184在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平比轉(zhuǎn)染之前更高(均P<0.05)。 轉(zhuǎn)染miR-184促使miR-184的表達(dá)能夠抑制HTR8/SVneo和Swan71細(xì)胞的增殖[19]。 在HTR8/SVneo細(xì)胞中,各時(shí)間段si-miR-184的吸光值與si-NC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),在A549細(xì)胞中,各時(shí)間段si-miR-184的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05);在進(jìn)行的凋亡實(shí)驗(yàn)中,利用si-miR-184的轉(zhuǎn)染降低miR-184的表達(dá)水平能夠阻礙女性滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡作用,而miR-184的過度表達(dá)能夠明顯推動(dòng)女性滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡作用[20]。

綜上所述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以通過從表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和凋亡等多方面綜合系統(tǒng)的分析了miR-184在女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織中的表達(dá)機(jī)制和其對(duì)細(xì)胞的增殖凋亡的影響,對(duì)后續(xù)進(jìn)一步對(duì)女性滋養(yǎng)層細(xì)胞組織疾病的預(yù)防、治療和早發(fā)現(xiàn)具有非常重要的參考價(jià)值。通過抑制miR-184表達(dá)可以調(diào)控和誘導(dǎo)滋養(yǎng)層的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,臨床上可以采用miR-184調(diào)節(jié)方式調(diào)控其滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡來對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞異常導(dǎo)致的相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防和治療。