周立新,孫忠人,尹洪娜

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱150006)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是脊髓和馬尾神經(jīng)細胞急性創(chuàng)傷性損傷,進而引發(fā)組織離斷、出血,產(chǎn)生不可逆病理性改變,脊髓功能喪失的一種疾病[1]。損傷可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性是外力壓迫脊髓實質(zhì)導致實質(zhì)變形,影響正常的血液供應,并表現(xiàn)為出血、水腫或缺血[2];繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上所引起的炎癥反應、神經(jīng)元凋亡、脂質(zhì)過氧化、興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)積累、組織水腫等[3]。急性或亞急性期的繼發(fā)性損傷是SCI的治療重點。

熱休克蛋白(Hsps)是機體在發(fā)生缺血、高溫、氧化應激、重金屬和藥物等刺激時應激反饋而形成的蛋白質(zhì)[4]。在生物體內(nèi)廣泛存在,主要參與受損神經(jīng)元修復并清除受損蛋白質(zhì),同時介導細胞炎癥反應、凋亡、氧化應激等生理病理過程。其中,熱休克蛋白70(Hsp70)由于其高度保守性,經(jīng)常被作為反應應激現(xiàn)象的檢測指標。最近發(fā)現(xiàn),Hsp70對繼發(fā)性SCI的損傷修復起著至關(guān)重要的作用,故本文總結(jié)Hsp70促進脊髓損傷恢復的研究進展,以期為進一步提高SCI研究水平提供借鑒。

1 Hsp70概述

熱休克蛋白是所有物種中表達最高的細胞蛋白之一,它們占非應激細胞總蛋白質(zhì)的1%～2%。然而,當細胞被加熱或受到其他應激源時,Hsps的比例增加到所有細胞蛋白質(zhì)的4%～6%[5]。從整體來看,它們的分子量范圍在10～150 kDa。Hsps按照分子量的大小可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小分子Hsps。其中,Hsp70是熱休克蛋白家族中研究廣泛的Hsps。

Hsp70有N端核苷酸結(jié)構(gòu)域(NBD)和C端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)兩個結(jié)構(gòu)域。44 kD N端NBD具有腺苷三磷酸酶活性,并與Hsp70輔酶DnaJ結(jié)合。這些結(jié)構(gòu)域由一個保守的連接NBD和SBD的連接子連接,最近表明這對結(jié)構(gòu)域間的通信至關(guān)重要[6]。當ATP與NBD結(jié)合時,α-螺旋蓋會被打開,此時SBD與底物的親和力較弱,從而導致底物的釋放。而當ATP水解成ADP或NBD未結(jié)合核苷酸時,α-螺旋蓋會關(guān)閉,這樣底物就被鎖在底物結(jié)合袋中。此時,SBD與底物的親和力較強。因此,Hsp70功能的發(fā)揮需要ATP調(diào)控底物的結(jié)合和釋放,同時還需要一些輔助因子的協(xié)同和調(diào)控來實現(xiàn)[7]。第一類輔助因子是由Hsp40等輔助分子組成的伴侶,它們可以與Hsp70的NBD結(jié)合,刺激其ATP酶活性,從而加速ATP的水解[8]。同時,這些輔助因子還能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)移至Hsp70分子中。第二類輔助因子則是一類核苷酸交換因子,它們能夠促進ADP和ATP的交換,從而加快Hsp70與底物結(jié)合和釋放的周期[9]。第三類輔因子是與Hsp70的C端相互作用的蛋白,它將Hsp70結(jié)合的底物運送到溶酶體和蛋白酶體進行降解[10]。

在細胞內(nèi),Hsp70主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核、線粒體和細胞質(zhì)中。其中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體分布著兩個Hsp70家族成員:Hsp70-5(BIP/GRP78)和Hsp70-9(MTHSP70/GRP75),余下的Hsp70家族成員則分布于細胞核和細胞質(zhì)中[11]。根據(jù)表達情況,Hsp70在哺乳動物中主要有兩種表現(xiàn)形式。一種是通常存在于正常細胞中的結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白70(HSC70),表達量只在受到應激刺激后才略有上升;另一種是受應激刺激后作為保護性分子顯著升高,但平時僅在正常細胞中少量表達的誘導型Hsp70,是對應激最敏感的一類Hsps。

2 脊髓損傷后Hsp70表達的調(diào)節(jié)機制

熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factors,HSFs)介導了Hsp70的表達,主要通過特異性結(jié)合熱休克元件序列來調(diào)控Hsps的基因表達[12]。其中HSF1是必要的調(diào)控因子,在生理狀態(tài)下它與Hsps相結(jié)合,而在應激狀態(tài)下,它與Hsps分離并游離出來,游離的HSF1被蛋白激酶C磷酸化轉(zhuǎn)移至細胞核,進而形成活化的三聚體,促進更多的Hsps的產(chǎn)生[13]。相關(guān)研究表明,在繼發(fā)性脊髓損傷階段,神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的細胞膜骨架受損,線粒體結(jié)構(gòu)被破壞,神經(jīng)酰胺和活性氧大量產(chǎn)生,而HSFs被激活并發(fā)揮著促進Hsps產(chǎn)生的關(guān)鍵作用,從而保護受損神經(jīng)元[14]。

Hsps的表達是一個自我調(diào)節(jié)過程。正常條件下,Hsp70少量存在于細胞中,并與HSFs結(jié)合抑制HSFs活性。該條件下的HSFs與Hsp70基因的HSE區(qū)域的結(jié)合水平很低[15]。在應激反應發(fā)生時,胞內(nèi)變異蛋白、新生蛋白等蛋白大量增加,與Hsp70高親合力結(jié)合,游離的HSFs數(shù)量增多活性增加。HSFs與HSE通過磷酸化和聚合反應高水平快速大量結(jié)合生成HSF/HSE復合體,促進Hsp70基因的高效轉(zhuǎn)錄,直至Hsp70的水平足夠結(jié)合HSF使其活性降低,進而關(guān)閉熱休克基因的表達。

3 Hsp70治療脊髓損傷的作用機制

在脊髓損傷發(fā)生后,蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集會積累神經(jīng)毒素,進而引發(fā)炎癥反應和細胞凋亡。Song等[16]使用DNA微陣列技術(shù)證明Hsp70是SCI后最常產(chǎn)生并且最先表達的蛋白質(zhì)之一。Hsp70使脊髓損傷后錯誤折疊或非正常聚集的蛋白正常折疊或降解,維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定,并且在抗炎、抗細胞凋亡和抗氧化應激等生理和病理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

3.1 分子伴侶作用 大多數(shù)蛋白質(zhì)在折疊、運輸和裝配過程中都需要其他蛋白質(zhì)的參與。在折疊新的肽鏈形成蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的過程中,這種特殊的蛋白質(zhì)起著穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用。但本身不發(fā)生任何變化,也不參與蛋白質(zhì)的形成。這類能夠促進新肽鏈的折疊、多聚體合成、識別并防止錯誤折疊蛋白產(chǎn)生的蛋白質(zhì)稱為分子伴侶[17]。

Hsp70是目前發(fā)現(xiàn)的主要伴侶蛋白之一,是一種非特異性的細胞保護蛋白。在各種應激條件下,Hsp70在細胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各種細胞器之間通過伴隨蛋白分子進行轉(zhuǎn)運。主要作用是使蛋白質(zhì)多肽鏈在胞漿中穩(wěn)定;加速折疊失調(diào)蛋白的再折疊;與核糖體上新生多肽結(jié)合參與合成新的蛋白而取代那些破壞嚴重不可修復的蛋白;同時通過阻礙變性蛋白疏水區(qū)的聚集,增強其溶解性等方式促進變性蛋白的恢復或加速其降解和清除,從而提高細胞對應激的耐受性,維持細胞的正常生理功能等[18]。SCI后可繼發(fā)蛋白質(zhì)聚集物的錯疊和累加。Wang等[19]的研究結(jié)果證實,通過提高Tau蛋白液-液分離液滴的流動性,Hsp70可以有效地抑制錯誤折疊蛋白的積累。

3.2 抑制炎癥反應 脊髓損傷后,星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和T細胞激活并浸潤損傷部位引起大量炎性因子(IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6等)釋放,導致組織損傷和神經(jīng)變性,血脊髓屏障被破壞,神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞凋亡以及膠質(zhì)瘢痕的形成,最終致使神經(jīng)功能受損[20-21]。因此,抑制炎性反應可以減輕SCI的繼發(fā)性損傷,防止機體功能的進一步損害。

根據(jù)Chamney等[22]的研究,在小鼠脊髓損傷后,Hsp70的上調(diào)可以有效地減少肌肉中白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達水平。Xu等[23]通過SCI的體內(nèi)和體外模型發(fā)現(xiàn),Hsp70主要通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路的活化來減少SCI后炎癥因子的表達。生理條件下,NF-κB與NF-κB抑制(IκB)蛋白以無活性的方式結(jié)合存在于細胞質(zhì)中,當機體受到應激刺激時,IκB 活激酶復合物(IKK)被激活,發(fā)生磷酸化和泛素化,NF-κB與IκB解離進入細胞核,與靶基因中NF-κB 的結(jié)合位點相結(jié)合,啟動靶基因轉(zhuǎn)錄,下游炎性因子表達增加[24]。因此已有研究[25]推測,Hsp70抑制NF-κB活化可能的機制為:①Hsp70通過結(jié)合IκB激酶(IKK)的亞單位IKKγ,抑制其活性,阻礙IκB降解,進而影響NF-κBp65入核;②熱休克反應可使胞漿中游離IκB的數(shù)量增多,從而干擾激活的NF-κB向胞核移位;③Hsp70與NF-κB競爭核膜孔通道,阻礙NF-κB向胞核轉(zhuǎn)移,最終阻礙其功能發(fā)揮。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn),低頻脈沖電磁場可以通過上調(diào)Hsp70的表達,減少炎癥和氧化應激,促進SCI后功能恢復。因此,通過抑制炎癥因子的表達,SCI后活化的Hsp70能夠減緩脊髓組織的進一步損傷。

3.3 抑制凋亡反應 神經(jīng)細胞凋亡是引起脊髓繼發(fā)性損害的一種重要病理機制。在SCI后,軸突的受損導致神經(jīng)細胞無法得到營養(yǎng)供應,進而觸發(fā)神經(jīng)細胞凋亡。這種凋亡會阻斷神經(jīng)傳導通路,從而導致繼發(fā)性的SCI。因此,抑制神經(jīng)細胞的凋亡對于促進SCI的恢復是非常有益的。

作為Hsps家族的重要成員,Hsp70在細胞中的表達可以抵抗應激誘導的細胞凋亡,并通過參與不同的凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑直接影響細胞凋亡。Hsp70參與的經(jīng)典的凋亡途徑主要有兩種:一種是由半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-9(Caspase-9)啟動的內(nèi)源性凋亡,依賴于線粒體釋放因子。另一種是死亡受體介導的外源性凋亡,由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)的激活觸發(fā)。最終,兩種凋亡途徑均由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)完成。其中依賴于線粒體釋放因子的內(nèi)源性細胞凋亡是導致SCI后持續(xù)細胞丟失的關(guān)鍵因素。

B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白通常位于線粒體外膜上,其作用是阻止Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bax)形成的孔道,從而調(diào)節(jié)線粒體介導的細胞凋亡[27-28]。當SCI發(fā)生時,線粒體介導的細胞凋亡常常被觸發(fā),導致Bcl-2表達量降低,細胞色素C逸出線粒體進入細胞質(zhì)基質(zhì)中,與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)結(jié)合,從而激活了Caspase-9,觸發(fā)了Caspase級聯(lián)反應,最終導致細胞凋亡的發(fā)生。此外,外源性凋亡是細胞外損傷因子(如1L-1β、TNF-α等)與細胞膜表面受體結(jié)合,募集到細胞內(nèi)與死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FADD形成復合物。最后,FADD通過死亡效應結(jié)構(gòu)域的二聚體與前體Caspase-8結(jié)合。形成死亡誘導信號復合體(DISC),Caspase-8被激活,Caspase-8繼而激活Caspase-3,導致細胞凋亡[29]。

SCI后,合成增加的Hsp70通過不同途徑和機制阻止細胞發(fā)生凋亡,使機體從各種應激反應中得到恢復。Nasouti等[30]發(fā)現(xiàn),海藻糖的作用機制是通過增加熱休克蛋白27和熱休克蛋白70的表達來發(fā)揮其保護作用。這可以防止細胞色素c從線粒體中釋放,并減少Caspase-3的表達,最終保護脊髓免受進一步的損傷。Hsp70抑制細胞凋亡可能有兩種途徑:首先,在線粒體外,Hsp70與Apaf1結(jié)合,募集到凋亡小體。該過程主要有兩種機制阻礙功能性凋亡小體的組裝來抑制凋亡,第一種是通過直接結(jié)合Apaf-1和抑制低聚。第二種是通過保持低聚物,使Apaf-1 CARD結(jié)構(gòu)域不暴露,從而使低聚物的構(gòu)象與前體半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Procaspase-9)募集不相容。其次,Hsp70還可以通過與TNF相關(guān)的凋亡誘導受體1/2(TRAIL-R1/2)結(jié)合來阻止凋亡。純化的Hsp70體外實驗[31]表明,Hsp70能抑制細胞色素c/DATP介導的Caspase激活,但不抑制Apaf-1的寡聚。Hsp70通過與Apaf-1直接結(jié)合來抑制功能性凋亡小體的形成,細胞凋亡過程被抑制。除此之外,在神經(jīng)缺血模型中,Hsp70通過提高Bcl-2水平來抑制細胞凋亡[32]。與Hsp70作用的另一種凋亡調(diào)節(jié)蛋白是Bid蛋白,它被Caspase-8激活,將Bax蛋白(Bcl-xl protein)轉(zhuǎn)移到線粒體膜,促進線粒體釋放各種死亡因子,Hsp70通過抑制Bid蛋白的激活來阻斷細胞凋亡過程。Gabai等[33]證實,在腫瘤壞死因子誘導的細胞凋亡中,突變型Hsp70和野生型Hsp70均能抑制Caspase-8和Bcl-2家族成員促凋亡蛋白Bid的激活,產(chǎn)生抗凋亡作用。

3.4 抗氧化應激 氧化應激是氧自由基及其代謝產(chǎn)物過度累積的一種病理狀態(tài),它破壞人體的抗氧化防御系統(tǒng)。活性氧(ROS)是引起氧化應激的重要因素,包括羥基自由基、過氧化氫和超氧陰離子等。SCI發(fā)生后,損傷區(qū)域處于缺血缺氧狀態(tài),線粒體中鈣離子急劇上升,產(chǎn)生的自由基會超過過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)等內(nèi)源性抗氧化劑的中和能力。

相關(guān)研究[24]表明,Hsp70可以促進抗氧化劑CAT、GSH和SOD的表達。Hsp70的表達上調(diào)可以增加CAT和SOD的產(chǎn)生,進而降低誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和ROS的水平。Xu等[34]在膠質(zhì)細胞的研究中證明,谷胱甘肽的產(chǎn)生增加可以促進HSP70的過表達進而使細胞免受葡萄糖剝奪和H2O2的損傷。朱興等[35]進一步表明,在缺血再灌注大鼠模型中,Hsp70合成的增加與GSH的增加具有一致性。因此,推測Hsp70對自由基清除劑的產(chǎn)生和活性具有促進增強作用,可以清除大量自由基,緩解脂質(zhì)過氧化。SOD在平衡機體氧化和抗氧化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,能明顯緩解脊髓損傷,是細胞內(nèi)天然的氧自由基清除劑。現(xiàn)有研究[36]認為,一方面,Hsp70可促進體內(nèi)SOD的產(chǎn)生,抑制NADPH氧化酶(Nox),使ROS的生成以反饋的方式降低。另一方面,通過直接釋放和提高內(nèi)源性SOD水平,緩解機體的氧化應激。因此,脊髓損傷后,增加Hsp70的表達可以有助于提高脊髓神經(jīng)元對氧化應激的抵抗能力。這是通過促進抗氧化劑蛋白的產(chǎn)生來實現(xiàn)的,從而減少氧化應激的損害,并有助于保護神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能不受進一步的損傷。

4 小結(jié)與展望

綜上所述,Hsp70與脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復密切相關(guān)。而且在發(fā)揮功能時需要相對應的輔助分子伴侶Hsp40,核苷酸交換因子以及與Hsp70的C端相互作用的蛋白幫助,以便發(fā)揮其多樣性功能。同時其表達也是需HSFs介導的自我調(diào)節(jié)過程。脊髓損傷后,作為保護分子的Hsp70表達增加,并發(fā)揮分子伴侶,抑制炎癥反應,抑制凋亡反應,抗氧化應激等保護作用,緩解脊髓繼發(fā)性損傷,提供以Hsp70為基礎(chǔ)的脊髓損傷治療新思路。盡管Hsp70能夠加速折疊失調(diào)蛋白的再折疊,促進變性蛋白的恢復或加速其降解和清除,但Hsp70通過什么途徑?jīng)Q定底物去向目前尚不清楚。目前,脊髓損傷領(lǐng)域的研究熱點之一是如何誘導SCI后Hsp70的表達,促進神經(jīng)功能的恢復。近年來,通過藥物、低頻脈沖等方法誘導Hsp70表達的研究雖有一定進展,但尚無臨床應用報道。此外,迄今為止的許多研究都集中在Hsp70單獨作用上,但這種蛋白的全部治療效果可能取決于它與其他分子聯(lián)合應用以更好地發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此,探索Hsp70形成和作用的深層機制,研發(fā)對Hsp70誘導效率高、經(jīng)濟成本低且不良反應小的藥物,探究將Hsp70與其它分子共同應用,將是今后一個重要的研究方向。