陳 宇,趙 雅,,王 林

(1.陜西中醫(yī)藥大學,陜西 咸陽 712046;2.西安市第一醫(yī)院檢驗科,陜西 西安 710002)

眼表是位于上下眼瞼緣灰線之間的眼球表面的全部黏膜上皮,包括角膜上皮、結(jié)膜上皮、淚器、淚道等[1]。眼表本身存在一個相對穩(wěn)定的微環(huán)境,能夠刺激機體啟動免疫應答對抗病原菌入侵,成為眼表抗炎防線的主力軍[2]。眼表菌群處在一種動態(tài)平衡中,在某些內(nèi)外界因素(包括衰老、佩戴隱形眼鏡、植入角膜假體、局部使用抗生素等)的干擾下,這種平衡狀態(tài)會被打破,導致定植在眼表的細菌進入眼內(nèi)大量增殖[3],繼而成為感染性眼病的主要病原菌。眼部發(fā)生感染會給眼球組織帶來損傷,損害視覺功能和嚴重影響心理健康。因此,明確眼表常見定植菌群分布并且有針對性的應用抗生素對治療眼部感染至關(guān)重要。本研究收集西安市第一醫(yī)院2021年7月至2022年9月健康體檢人群眼結(jié)膜囊標本共93例,通過對眼表定植菌群分布特征及常見細菌抗生素耐藥性進行分析,為臨床眼部感染的早期經(jīng)驗用藥提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安市第一醫(yī)院2021年7月至2022年9月93例健康體檢人群作為研究對象,其中男45例,女48例。納入標準:所有研究對象過去一個月未使用抗生素、無淚道炎、淚囊炎、瞼緣炎等眼部疾病、無干燥綜合征、糖尿病等影響眼表的全身性疾病;研究對象對本研究均知情同意。標本由西安市第一醫(yī)院眼科醫(yī)師收集后送至檢驗科微生物室進行細菌培養(yǎng)、鑒定及體外藥敏試驗。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(德國布魯克公司),Vitek 2 Compact 全自動細菌藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司),Vitek 2 配套藥敏卡GP67藥敏板卡(最低抑菌濃度MIC法),37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基為哥倫比亞血平板、巧克力平板(鄭州安圖公司),聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增儀(美國Bio-Rad公司),電泳儀(北京六一儀器廠),Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司),2×HieffTM PCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司),耐藥基因分子檢測陰性對照菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923,陽性對照菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213購自美國標準菌庫ATCC。

1.2.2 細菌培養(yǎng)及鑒定:嚴格遵循《全國臨床檢驗操作規(guī)程》操作指導,將采集的標本接種在哥倫比亞血平板培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基中,置于35 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h。根據(jù)細菌菌落特點和革蘭染色結(jié)果進行初步鑒定,再采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀進行細菌鑒定。

1.2.3 藥敏試驗:采用VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀進行藥敏試驗,結(jié)果判定嚴格按照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標準執(zhí)行。

1.2.4 mecA基因檢測:將收集凍存的菌株常溫復蘇,接種于血瓊脂平板上,過夜孵育。采用生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取,引物交由上海生工生物有限公司設計合成,上游引物:5’-ACGAAGAATATAATAAATTAACCGAA-3’,下游引物:5’-GATTTGCCAATTAAGTTTGCAT-3’。反應體系共20 μl:DNA模板1 μl,上、下游引物各1 μl,Master PCR Mix 10 μl,ddH2O 7 μl。熱循環(huán)參數(shù):95 ℃預變性4 min;94 ℃變性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。試驗分別采用金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923標準菌株作為陽性對照和陰性對照。擴增產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min,最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行分析,計數(shù)資料以[例 (%)]表示,采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)膜囊標本所分離的細菌分布和構(gòu)成比 對93例健康體檢人群結(jié)膜囊標本經(jīng)培養(yǎng),87例培養(yǎng)陽性,陽性率93.55%,其中39例培養(yǎng)出一種細菌,剩余48例培養(yǎng)出兩種或兩種以上細菌。共分離出168株細菌,G+菌150株(89.29%),G-菌15株(8.93%),真菌3株(1.79%)。具體菌株分布結(jié)果見表1。

表1 87例眼部結(jié)膜囊標本的細菌分布和構(gòu)成比(n=168)

2.2 主要革蘭陽性球菌耐藥情況 所分離的主要凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌)對多種抗生素呈現(xiàn)出耐藥性,未發(fā)現(xiàn)對莫西沙星、利福平和萬古霉素耐藥的菌株,75株凝固酶陰性葡萄球菌有39株為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci,MRCoNS),占52.00%(39/75)。主要革蘭陽性球菌耐藥情況,見表2。

表2 眼部常見革蘭陽性球菌耐藥情況

2.3 MRCoNS與MSCoNS兩組耐藥率比較 MRCoNS對抗生素的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci,MSCoNS),其中青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、復方新諾明五種藥物耐藥率差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表3。

表3 MRCoNS與MSCoNS耐藥率比較[例(%)]

2.4 眼部和同期其他部位所分離凝固酶陰性葡萄球菌耐藥率比較 統(tǒng)計藥敏結(jié)果顯示,非眼部所分離的凝固酶陰性葡萄球抗生素耐藥率及MRCoNS所占比例總體高于眼部分離株,兩者耐藥率均較高的抗生素有青霉素、克林霉素和紅霉素。兩組對喹諾酮類藥物、慶大霉素、復方新諾明耐藥率差異有統(tǒng)計學(均P<0.05)。見表4。

表4 眼部和非眼部葡萄球菌耐藥率比較[例(%)]

2.5 耐藥基因mecA檢測結(jié)果 耐甲氧西林耐藥基因mecA經(jīng)PCR擴增出664 bp大小的DNA片段,對75株凝固酶陰性葡萄球菌mecA基因進行檢測,結(jié)果顯示40株mecA基因陽性,其中39例與Vitek 2 Compact全自動細菌藥敏分析儀苯唑西林耐藥所預測的MRCoNS一致,1例與儀器檢測結(jié)果顯示的苯唑西林敏感不符,符合率為97.5%。剩余35株菌株mecA基因陰性,與儀器所檢測的苯唑西林敏感均相符。試驗所設立的陰陽對照結(jié)果與預期一致,耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌mecA耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。

1～4:mecA陽性菌株;5:陽性對照;6:陰性對照

3 討 論

眼表核心微生物群是由凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌等革蘭陽性菌為主的多種細菌共同組成。凝固酶陰性葡萄球菌是定植在人體皮膚黏膜上一種常見的條件致病菌,也是淚囊炎、結(jié)膜炎術(shù)后眼內(nèi)炎等感染性眼病的主要致病菌[4-7]。在本研究中,結(jié)膜囊標本培養(yǎng)陽性率是93.55%,高于國內(nèi)外報道的正常結(jié)膜囊樣本中細菌檢出率為20.60%～87.00%的水平,造成這種差異可能與培養(yǎng)時間、納入研究對象的標準及地理位置不同有關(guān)。在眼部定植菌分布特征方面,我們的研究結(jié)果與國內(nèi)外其他一些研究結(jié)果基本一致[8-9],葡萄球菌是眼表主要定植菌,革蘭陰性菌在我們的研究結(jié)果中占比較小,以流感嗜血桿菌和不動桿菌為主。

隨著新型有效的藥物不斷被推出,供眼科醫(yī)師治療眼表疾病時可選擇的藥物種類也相應增加,但由于多重耐藥菌株在全球范圍內(nèi)普遍流行[10],這可能會降低抗生素治療感染性眼病的有效性[11]。我們的藥敏結(jié)果提示眼部凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌和人葡萄球菌)對青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素的耐藥率均超過50.00%,對眼科常用藥物環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復方新諾明的耐藥率在20%左右。同時對不同部位所分離的凝固酶陰性葡萄球菌耐藥率進行比較,非眼部葡萄球菌對喹諾酮類藥物的耐藥率遠高于眼部且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有關(guān)細菌耐藥性的報道在不同地區(qū)差異性比較大,這可能與用藥習慣和生活環(huán)境有關(guān)。例如,有研究[12-14]報道,葡萄球菌對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和莫西沙星的敏感率低,Laura 等[12]報道中指出,葡萄球菌對甲氧西林和紅霉素的耐藥率較高。本研究未發(fā)現(xiàn)眼部凝固酶陰性葡萄球菌對莫西沙星、利福平和萬古霉素耐藥,這提示眼科醫(yī)師優(yōu)先使用這些藥物治療凝固酶陰性葡萄球菌引起的眼部感染可能會有比較理想的治療效果。目前,雖還未有眼部分離出耐萬古霉素葡萄球菌的報道[15-18],但隨著高級別抗生素在臨床上的使用越來越多,不免使我們對萬古霉素治療效果產(chǎn)生擔憂,這需引起臨床醫(yī)師的足夠重視,按照藥敏結(jié)果合理選擇藥物。

有文獻[15]指出,MRCoNS菌株會明顯增加葡萄球菌對其他抗生素的耐藥性。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)MRCoNS組對抗生素的耐藥率明顯高于MSCoNS組,其中青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、復方新諾明五種藥物耐藥性比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。MRS耐藥機制多由mecA基因介導,其基因表達產(chǎn)物是低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a,會降低與β-內(nèi)酰胺類藥物的親和力(五代頭孢菌素除外),由它引起的眼部感染除增加治療難度外也可能會導致患者預后不良,同時此類細菌易在院內(nèi)進行傳播,也是院感重點監(jiān)測的耐藥菌[19]。我們研究中采用的PCR檢測mecA基因和VITEK 2 Compact儀器法對MRCoNS苯唑西林耐藥性預測的結(jié)果符合率是97.5%,其中1例mecA基因陽性菌株經(jīng)儀器檢測顯示對苯唑西林敏感,這可能與苯唑西林是誘導mecA基因表達的一種弱誘導劑以及mecA第二啟動子的錯義突變和單一突變有關(guān)[20],當“隱形”MRCoNS接觸到β-內(nèi)酰胺類抗生素時,便可能轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨饶退幘?所以將檢測耐藥表型和mecA基因或青霉素結(jié)合蛋白2a的方法聯(lián)合起來對篩選或鑒定耐甲氧西林葡萄球菌尤為重要。

綜上所述,G+球菌為眼表的主要定植菌,其中凝固酶陰性葡萄球菌為主要優(yōu)勢菌,我們應加強對葡萄球菌特別是MRS耐藥性的監(jiān)測,指導臨床根據(jù)藥敏結(jié)果合理規(guī)范使用抗生素。