常曉青，姜良霞，張樸堯，譚 韜

(1.昆明理工大學(xué) 靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，云南 昆明 650021；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，生殖醫(yī)學(xué)中心，生殖內(nèi)分泌與輔助生殖技術(shù)北京市重點實驗室，輔助生殖教育部重點實驗室，北京 100191)

0 引 言

胎盤在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中是一個暫時性的器官，對于維持妊娠和胎兒發(fā)育至關(guān)重要[1-2].胎盤發(fā)育紊亂會導(dǎo)致很多妊娠相關(guān)疾病的產(chǎn)生，如：妊娠期高血壓、胎盤植入性疾病、妊娠期糖尿病和早產(chǎn)等[3-8].胎盤從囊胚期的滋養(yǎng)外胚層發(fā)育而來[9]，滋養(yǎng)外胚層由滋養(yǎng)層干細(xì)胞(Trophoblast Stem Cells,TSCs)組成，TSCs是胎盤分化細(xì)胞的前體細(xì)胞，能夠分化成所有的滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblast Cell) 亞型[10].靈長類動物的滋養(yǎng)層細(xì)胞主要有三種亞型：細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(Cytotrophoblasts,CT)、合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞(Syncytiotrophoblasts,ST)和絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(Extravillous Trophoblasts,EVT).其中ST和EVT是由CT分化而來的[11].不同的滋養(yǎng)層細(xì)胞亞型負(fù)責(zé)胎盤不同的功能：ST主要負(fù)責(zé)母體和胎兒之間的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物交換，ST是由單核細(xì)胞融合而成的多核細(xì)胞[12]，異常的細(xì)胞融合會引發(fā)一些妊娠相關(guān)疾病，如先兆子癇和胎兒發(fā)育不全[13-14].EVT主要負(fù)責(zé)母體血液的供給，EVT從絨毛的末端侵入蛻膜，重塑母體螺旋動脈，使母體血液能夠持續(xù)地供應(yīng)給胎盤[15-18]，較淺或較深的EVT侵襲都會導(dǎo)致一系列的妊娠失敗，如胎兒宮內(nèi)生長受限、反復(fù)流產(chǎn)等[19-21].非人靈長類動物及其滋養(yǎng)層細(xì)胞模型可以用來研究靈長類動物胎盤發(fā)育保守與特異性的機(jī)制，因為非人靈長類動物與人類的胎盤絨毛結(jié)構(gòu)、血液屏障、滋養(yǎng)細(xì)胞侵入后螺旋動脈重塑模式以及轉(zhuǎn)化方式等都較為相似[22].而小鼠與人類胎盤的結(jié)構(gòu)及功能存在較大差異：小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲程度較淺，而人類滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲較深且較為廣泛；小鼠胎盤為迷路結(jié)構(gòu)，人類胎盤為絨毛結(jié)構(gòu)；小鼠子宮動脈的轉(zhuǎn)化依賴于母體因素(子宮NK細(xì)胞)，而人類主要依賴于滋養(yǎng)層細(xì)胞等[23-24].

由于滋養(yǎng)細(xì)胞在動物胎盤發(fā)育中至關(guān)重要，所以建立靈長類動物滋養(yǎng)層細(xì)胞系對靈長類動物胎盤研究具有重要意義.早在1998年就已經(jīng)成功建立了小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞系[25]，在含有成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor 4,FGF4)、NODAL信號通路相關(guān)因子、肝素(Heparin)以及胎牛血清(fetal bovine serum)的條件下，可以從小鼠囊胚中分離得到小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞(mouse Trophoblast Stem Cells,mTSCs)[26].但由于小鼠和靈長類胎盤具有較大差異，所以,小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞系的方法不完全適用于靈長類動物滋養(yǎng)層干細(xì)胞系的建立[27]，建立靈長類動物滋養(yǎng)層細(xì)胞模型有助于胎盤發(fā)育相關(guān)分子機(jī)制的研究.目前已有不同實驗室建立了不同來源的靈長類滋養(yǎng)層細(xì)胞系，本文將圍繞靈長類動物滋養(yǎng)層細(xì)胞系的建立、研究進(jìn)展以及滋養(yǎng)層細(xì)胞系的應(yīng)用進(jìn)行綜述.

1 組織來源的靈長類滋養(yǎng)層細(xì)胞

1.1 絨毛膜癌來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞系

1968年，Hertz[28]從人類絨毛膜癌中分離得到了可以連續(xù)傳代的滋養(yǎng)層BeWo細(xì)胞系，這是第一個可以在培養(yǎng)過程中合成激素的人類細(xì)胞系.1969年，Kochler等人[29]將BeWo細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)傳代，得到了可以產(chǎn)生人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、人絨毛膜生長素(HCS)和孕酮(progesterone)的JEG細(xì)胞系，后續(xù)也獲得了其他人類絨毛膜癌細(xì)胞系，如JAR、ACH-3P 和AC1-M59等細(xì)胞系[30-31].絨毛膜癌細(xì)胞系有妊娠早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的許多結(jié)構(gòu)和功能特征，目前已被廣泛用于胎盤體外模型研究[32-34]：BeWo細(xì)胞系是目前應(yīng)用最廣泛的絨毛滋養(yǎng)層融合細(xì)胞培養(yǎng)模型[35]，可以通過添加毛喉素(Forskolin,cAMP的激活劑)來促進(jìn)BeWo細(xì)胞融合[36]，處理后的細(xì)胞會表達(dá)參與滋養(yǎng)細(xì)胞融合的膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子1(Glial Cell Missing 1,GCM_1)[37]；JEG和JAR細(xì)胞系經(jīng)常作為研究絨毛膜癌的細(xì)胞模型[38-39].上述細(xì)胞系容易在體外進(jìn)行培養(yǎng)和操作，但它們來源于惡性腫瘤，與正常的滋養(yǎng)層細(xì)胞有一定區(qū)別，并且部分細(xì)胞系長時間傳代后不能用于模仿體內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞狀態(tài).

1.2 胎盤直接分離滋養(yǎng)層細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化細(xì)胞系

1986年，Kliman等人從人足月胎盤中直接分離得到了可在體外培養(yǎng)的單核滋養(yǎng)層細(xì)胞，之后Orendi等人[40]使用Percoll梯度法，從妊娠早期胎盤及其絨毛膜組織中分離得到了純度更高的CT (純度達(dá)80%)，施瓊等人[41]使用組織塊培養(yǎng)法，也得到了同樣純度的CT.Petroff等人[42]和Serjilus等人[43]使用磁珠和流式分選方法進(jìn)一步提純細(xì)胞，從胎盤中分離得到了純度大于97%的CT.直接從胎盤組織分離得到的滋養(yǎng)層細(xì)胞系為單核細(xì)胞，它們具有成熟及未成熟滋養(yǎng)層細(xì)胞的多種結(jié)構(gòu)特征，如：細(xì)胞表達(dá)KRT7(也稱為CK7)、TEAD4、HAND1、ELF5等滋養(yǎng)層細(xì)胞標(biāo)志物和上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)，不表達(dá)波形蛋白(vimentin)[44-45]，一些單核滋養(yǎng)層細(xì)胞會表達(dá)分化的ST標(biāo)志物：hCG、人胎盤催乳素(Human Placental Lactogen,HPL)和妊娠特異性β1糖蛋白(Pregnancy-specific β1-glycoprotein,SP1)，并且會通過單核滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合形成合胞體細(xì)胞[46].但是這些直接從胎盤組織分離而來的細(xì)胞生命周期短，難以穩(wěn)定建系，并會自發(fā)地融合，不利于對其進(jìn)行長期研究.

使用含有SV40大T抗原(simian virus 40 large T antigen)慢病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染從人早期妊娠胎盤中分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞，可以得到生命周期更長的滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)化細(xì)胞系HTR-8/SVneo[47]和SGHPL[48].HTR-8/SVneo細(xì)胞系表達(dá)CK8和CK18，并分泌hCG.SGHPL細(xì)胞系則與絨毛外滋養(yǎng)層最為相似，具有原代絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系的多種特征：表達(dá)KRT7、CD9和HLA-G并分泌hPL[49].HTR-8/SVneo和SGHPL細(xì)胞系可以作為體外細(xì)胞模型，用于研究早期妊娠期胞外滋養(yǎng)細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，是目前研究胞外滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移和增殖最常用的細(xì)胞系[50-51].HTR-8/SVneo和SGHPL滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)化細(xì)胞系是滋養(yǎng)層細(xì)胞來源的，但兩者都為轉(zhuǎn)化狀態(tài)，僅有滋養(yǎng)層細(xì)胞的部分特征，如：HTR-8/SVneo細(xì)胞系高表達(dá)波形蛋白，但不表達(dá)KRT7和E-Cadherin[52]；HTR-8/ SVneo細(xì)胞系包含上皮細(xì)胞和間充質(zhì)樣細(xì)胞，是一類混合細(xì)胞群體[53]；SGHPL細(xì)胞系的壽命有限(20～25代),所以，滋養(yǎng)層細(xì)胞的研究仍然存在一定障礙.

2 靈長類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞系

2.1 BMP4誘導(dǎo)靈長類胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)層細(xì)胞分化

胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)具有多能性并且能夠分化為機(jī)體所有的細(xì)胞類型[54].很多研究者都在研究ESCs向滋養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，其中最常見的方法是使用BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4)進(jìn)行誘導(dǎo).Xu等人[55]分別將1、10和100 ng/mL的BMP4加入到不同的人類胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)系：H1，H7，H9和H14中，可以誘導(dǎo)hESCs發(fā)生劑量依賴性的形態(tài)學(xué)改變，出現(xiàn)了體積增大并且形態(tài)扁平的細(xì)胞，與滋養(yǎng)細(xì)胞或胎盤發(fā)育相關(guān)的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子TFAP2、MSX2、SSI3、GATA2和GATA3在經(jīng)過BMP4處理后的細(xì)胞中都顯著上調(diào)，滋養(yǎng)層標(biāo)志物如CGA、CGB、MMP9、KRT7、GCM1、HLA-G1和CD9的表達(dá)增強(qiáng)，且多能性相關(guān)的基因均顯著下調(diào).細(xì)胞上清液中hCG、雌二醇(estradiol)和孕酮的含量明顯升高[55].BMP4的處理時間及使用濃度在不同的研究中具有較大的差異[56].但該方法誘導(dǎo)細(xì)胞系的增殖能力有限，表明它們的長期增殖還需要其他的因子的調(diào)節(jié)[55].并且BMP4不能特異性誘導(dǎo)滋養(yǎng)層譜系的分化，處理的hESCs會同時表達(dá)中胚層和內(nèi)胚層標(biāo)志物[57].

2.2 Activin/Nodal、FGF和BMP信號共同誘導(dǎo)靈長類胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)層細(xì)胞分化

Activin/Nodal和BMP信號可以調(diào)節(jié)早期hESCs譜系分離，當(dāng)抑制Activin/Nodal、激活BMP信號時，hESCs可以向滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化.在培養(yǎng)基中添加BMP4和Activin/Nodal的抑制劑SB431542培養(yǎng)hESCs后，細(xì)胞會向滋養(yǎng)層方向分化，具有滋養(yǎng)層細(xì)胞的形態(tài)和部分標(biāo)志物的表達(dá)[58-59].存在BMP4、添加ActivinA/Nodal的抑制劑SB431542/A83-01和FGF2的抑制劑PD173074時，可以進(jìn)一步加速hESCs向滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化.分化的細(xì)胞具有部分滋養(yǎng)層細(xì)胞的特征：表達(dá)KRT7和HLA-G，一些細(xì)胞瞬時表達(dá)CDX2；中胚層標(biāo)志物表達(dá)減少；細(xì)胞具有遷移能力；隨著分化時間的增加，培養(yǎng)基中會產(chǎn)生大量的hCG、孕酮、胎盤生長因子(placental growth factor)和HPL[60]，證明了得到的細(xì)胞為滋養(yǎng)層細(xì)胞樣細(xì)胞.

但是關(guān)于使用BMP4誘導(dǎo)hESCs向滋養(yǎng)層細(xì)胞樣細(xì)胞分化體系還存在一些爭議，如：在相同的培養(yǎng)條件下，Bernardo等人[57]只有4%～8%的細(xì)胞表達(dá)KRT7，而 Roberts等人[61]幾乎所有的細(xì)胞都表達(dá)KRT7；BMP4誘導(dǎo)的hESCs類似于胚外中胚層；ELF5的啟動子在hESCs分化的滋養(yǎng)層細(xì)胞樣細(xì)胞中不能模擬TSCs的低甲基狀態(tài)[61-62].因為滋養(yǎng)層細(xì)胞系的定義不清晰，所以Lee等人[63]在2016年使用人類早期胎盤的原代培養(yǎng)細(xì)胞定義了滋養(yǎng)層細(xì)胞系的4個標(biāo)準(zhǔn)：(1)HLA-I (human leukocyte antigen class I)的特殊表達(dá)：TS和ST不表達(dá)HLA-I，EVT表達(dá)HLA-C、E和G；(2)使用KRT7作為廣譜TS細(xì)胞的標(biāo)志物，TFAP2C和GATA3作為單核TS細(xì)胞的標(biāo)志物；(3)ELF5啟動子低甲基化；(4)C19MC miRNAs的高表達(dá)[63].通過抑制ActivinA/Nodal和FGF2，添加BMP4來誘導(dǎo)hESCs分化的滋養(yǎng)層細(xì)胞樣細(xì)胞并不完全符合以上4個標(biāo)準(zhǔn)，所以hESCs雖然可以分化為具備部分滋養(yǎng)層細(xì)胞特征的細(xì)胞，但相關(guān)研究還需要進(jìn)一步探索.

2.3 靈長類na?ve胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化

小鼠ESCs可劃分為na?ve和primed兩種狀態(tài).Na?ve狀態(tài)的ESCs具有與胚胎植入前上胚層(epiblast,EPI)細(xì)胞相似的特征，而primed狀態(tài)的ESCs則與胚胎植入后的EPI類似，目前已經(jīng)獲得了具有na?ve狀態(tài)的靈長類ESCs[64-65].最近有研究證明可以將na?ve hESCs轉(zhuǎn)化為人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞(hTSCs)：Guo等人[66]通過抑制ERK/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Nodal信號通路，可以高效地將na?ve hESCs轉(zhuǎn)化為hTSCs，該hTSCs表達(dá)胎盤TSCs相關(guān)的標(biāo)志物：KRT7、ITGA6、HAVCR1和GATA3等，還可將其誘導(dǎo)為CGB+/SDC+ST以及HLA-G+EVT.而primed hESCs則失去了該潛能，僅會向羊膜方向分化.Io等人[67]也得到了相似的研究結(jié)果.Cinkornpumin等人[68]使用Okae等人[69]的hTSCs培養(yǎng)條件(下一部分詳述)可將na?ve hESCs轉(zhuǎn)化為hTSCs，使用該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)分化-hTSCs(transdifferentiated-hTSCs)表達(dá)胎盤核心基因，并且能夠向EVT和ST分化.Dong等人[70]也在與Cinkornpumin等人相同的培養(yǎng)條件下得到了同樣的結(jié)果，其轉(zhuǎn)錄組(scRNA-seq)和染色質(zhì)可及性(ATAC-seq)分析表明，來自na?ve的hTSCs與來自囊胚的hTSCs相似，具有植入后滋養(yǎng)層的特征.以上結(jié)果證實了na?ve hESCs可以向滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分化.

3 靈長類胚胎來源的滋養(yǎng)層干細(xì)胞系

3.1 人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞系

上述絨毛膜癌來源和部分hESCs來源的人類滋養(yǎng)層細(xì)胞系并未完全符合Lee的4個標(biāo)準(zhǔn)，不能視為真正hTSCs.Genbacev等人[71]從妊娠早期絨毛膜上分離出人類滋養(yǎng)層祖細(xì)胞系TPBCs，該細(xì)胞系表達(dá)OCT4、KRT7和GATA4，使用Matrigel誘導(dǎo)分化，會導(dǎo)致OCT4表達(dá)下調(diào)，并誘導(dǎo)ST和EVT標(biāo)志物的表達(dá).但最近的研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞主要向EVT方向分化，這表明它們更類似于EVT前體細(xì)胞，而不是真正的hTSCs.隨后，Zdravkovic等人[72]從8細(xì)胞期的人類胚胎中獲得了類似hTSCs的UCSFB6細(xì)胞系.在含有bFGF、FCS和SB431542的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，UCSFB6細(xì)胞表達(dá)滋養(yǎng)層細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)錄因子TEAD4、CDX2、Gminin、GATA3、ELF5、EBES、GCM1和β-catenin，可以傳代數(shù)10次并維持未分化狀態(tài).UCSFB6細(xì)胞在存在Matrigel的條件下，可被誘導(dǎo)為表達(dá)KRT7、Integrinα1、HLA-G、VE-cadherin和VCAM1，并具有侵襲性的EVT，也可以將UCSFB6細(xì)胞誘導(dǎo)為表達(dá)hCG和人胎盤催乳素(CSH1)的多核ST.雖然UCSFB6細(xì)胞系表達(dá)滋養(yǎng)層標(biāo)志物，但其尚未被鑒定是否完全符合Lee提出的4個標(biāo)準(zhǔn).

2018年Okae等人[69]建立了包括TSCT和TSblast的hTSCs.Okae使用從妊娠早期胎盤分離出的CT、EVT和ST進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與WNT(Wingless/Integrated)和EGF(epithelial growth factor)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的基因在CT中表達(dá)升高.WNT和EGF是各種上皮干細(xì)胞增殖所必需的，包括皮膚干細(xì)胞和腸干細(xì)胞[73]，Okae發(fā)現(xiàn)在含有CHIR99021(WNT激活劑)、EGF、VPA(HDAC抑制劑)、Y27632(ROCK抑制劑)、TGF-β抑制劑：A83-01和SB431542的培養(yǎng)基中可以長期培養(yǎng)CT.這些具有增殖能力的CT核型正常，能夠正常增殖至少5個月，表達(dá)滋養(yǎng)層標(biāo)志物KRT7、GATA3、TFAP2C和TEAD4，并且HLA-ABC表達(dá)較弱，這些CT被命名為TSCT[69].在添加了Matrigel、NRG-1和A83-01的培養(yǎng)基中，TSCT會經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)，形成HLA-G+ EVT樣細(xì)胞.添加Forskolin的TSCT會融合形成合胞體，表達(dá)ST的標(biāo)志物，在多次傳代后仍維持上述功能.Okae使用相同的培養(yǎng)條件也可從人類囊胚中得到TSblast細(xì)胞，與TSCT具有相似的特征.轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化譜分析顯示TSblast和TSCT與CT類似.此外，小鼠TS細(xì)胞自我更新所需的轉(zhuǎn)錄因子CDX2、ESRRB和SOX2在人類CT、TSCT和TSblast細(xì)胞中的表達(dá)較低.TSblast和TSCT細(xì)胞中的ELF5的啟動子都為低甲基化，并且C19MC miRNAs在CT、TSCT和TSblast細(xì)胞中高表達(dá)[69,74].因此Okae等人建立的TSCT和TSblast細(xì)胞符合Lee的4個金標(biāo)準(zhǔn)，證明了TSCT和TSblast細(xì)胞是hTSCs.

3.2 非人靈長類動物滋養(yǎng)層干細(xì)胞系

非人靈長類動物與人類親緣關(guān)系相對較近，成熟的非人靈長類動物與人類胎盤的形態(tài)、免疫能力和胎盤侵襲行為等都較為相似，在某些情況下，可將人源化的抗體應(yīng)用于非人靈長類動物的胎盤研究[75].所以，非人類靈長類動物是研究人類胎盤的極好模型，非人靈長類動物滋養(yǎng)細(xì)胞干細(xì)胞(Non-human primates TSCs)可以作為未來評估靈長類滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育和功能的體外平臺.2007年，Vandevoort等人[76]從恒河猴囊胚中首次分離出具有滋養(yǎng)層干細(xì)胞特征的細(xì)胞.將恒河猴囊胚除去透明帶后在恒河猴胚胎成纖維細(xì)胞(REF)飼養(yǎng)層或無飼養(yǎng)層及生長因子(僅有人類胎盤膠原包被)條件下均可穩(wěn)定傳代培養(yǎng).該細(xì)胞系表達(dá)KRT7、CD9、CGB和SSEA1滋養(yǎng)層細(xì)胞特征，不表達(dá)CDX2，同時會表現(xiàn)出類似于EVT的侵襲行為，但在長期培養(yǎng)或β-雌二醇存在下，細(xì)胞會形成合胞體樣結(jié)構(gòu).細(xì)胞中還檢測到合胞素-2((Syncytin-2)和非經(jīng)典組織相容性抗原MAMU-AG的表達(dá).合胞素-2在滋養(yǎng)層細(xì)胞融合中發(fā)揮作用，MAMU-AG為非人類靈長類MHC I類基因[77].雖然該恒河猴細(xì)胞系可以分化為多核細(xì)胞和侵襲細(xì)胞，但它們也表達(dá)ICM/ESCs的標(biāo)志物OCT4以及STB的標(biāo)志物絨毛膜促性腺激素(CG)，并且未對該細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo)分化，因此研究者不能確定這些細(xì)胞是否是真正的非人靈長類TSCs.

2020年Schmidt等人[78]和Matsumoto等人[79]分別使用不同的方法得到非人靈長類滋養(yǎng)層干細(xì)胞系.Schmidt等人[78]通過分離孕早期和孕中期胎盤絨毛狀細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，使用hTSCs培養(yǎng)基(Okae等人的培養(yǎng)條件)培養(yǎng)，獲得了恒河猴TSCs系，該細(xì)胞系可以穩(wěn)定增殖.表達(dá)KRT7、GATA3、TEAD4、Tfap2c和TP63，并且可分化為恒河猴ST和EVT細(xì)胞.經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)恒河猴TSCs與同樣從早期胎盤發(fā)育而來的hTSCs相似，包括滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)錄因子和C19MC miRNAs的表達(dá)以及ELF5啟動子DNA低甲基化.恒河猴TSCs來源的ST和EVT表現(xiàn)出滋養(yǎng)層細(xì)胞特有的分化標(biāo)志，如ST細(xì)胞的CG分泌增加、CGA、CGB的表達(dá)，EVT細(xì)胞表達(dá)Mamu-AG和侵襲性相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶基因(MMP2).這表明了hTSCs培養(yǎng)條件可以用于恒河猴TSCs培養(yǎng)和體外分化.Tanaka等人[25]使用AFHBY培養(yǎng)基(含Activin A、FGF4、肝素、BMS493和Y27632)，從食蟹猴囊胚中建立了食蟹猴TSCs細(xì)胞系(macTSCs).macTSCs表達(dá)KRT7、GATA3、Tfap2c、VGLL1和HAND1，具有滋養(yǎng)細(xì)胞DNA甲基化狀態(tài)(ELF5啟動子低甲基化)，以及C19MC miRNAs的特異性表達(dá).macTSCs還具有向ST和EVT分化的能力：使用dbcAMP誘導(dǎo)macTSCs向ST和EVT分化，分化的細(xì)胞會形成多核細(xì)胞ST，表達(dá)ST細(xì)胞的標(biāo)志物GCM1、CGA和CGB，并分泌孕酮；也會出現(xiàn)侵襲性EVT樣細(xì)胞，其MMP2和Mafa-AG蛋白的水平表達(dá)增加.在異種嵌合體實驗中，macTSCs促進(jìn)了嵌合囊胚中滋養(yǎng)外胚層(TE)的發(fā)育.FGF4信號對維持并促進(jìn)小鼠TSCs的增殖是必不可少的，在Tanaka的這項研究中，F(xiàn)GF4也促進(jìn)了macTSCs的增殖，這是第一個被FGF4促進(jìn)增殖的靈長類滋養(yǎng)層細(xì)胞系.因為非人靈長類與人類胎盤的結(jié)構(gòu)較為相似，所以非人靈長類滋養(yǎng)層干細(xì)胞系的建立可以為分析人類與非人類靈長類動物胎盤發(fā)育的異同提供有價值的體外培養(yǎng)模型.

4 體細(xì)胞重編程來源滋養(yǎng)層干細(xì)胞系

研究者們希望能夠從高度分化的體細(xì)胞中建立TSCs，從而得到在基因上與患者匹配的TSCs.在最近的2項研究中，Servick[80]和Liu等人[81]發(fā)現(xiàn)OSKM(OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC)重編程系統(tǒng)并不局限于胚胎譜系的生成，在該過程中還存在一個滋養(yǎng)層分支，可以形成滋養(yǎng)層譜系.因此,他們將成人皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)TSCs(hiTSCs)，該hiTSCs能夠穩(wěn)定增殖到50代以上.使用原代CT與hiTSCs進(jìn)行全面的對比發(fā)現(xiàn)：(1)hiTSCs表達(dá)單核滋養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵基因標(biāo)志物，并且可以分化為EVT和ST;(2)hiTSCs和hTSCs分化的EVT、ST與原代相同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜相似;(3)與成纖維細(xì)胞和iPS細(xì)胞相比，hiTSCs還具有C19MC miRNAs的高表達(dá);(4)觀察到在hiTSCs中ELF5基因的啟動子和假定增強(qiáng)子區(qū)域有特異的開放染色質(zhì)可及性，與之前的低甲基化狀態(tài)結(jié)果一致;(5)hiTSCs還具有體內(nèi)分化的潛能[81].

以上不同方法得到的hTSCs具體對應(yīng)的是胚胎發(fā)育的哪個階段的滋養(yǎng)層譜系仍未知，所以Petropoulos等人[82]和Zhou等人[83]將hTSCs的轉(zhuǎn)錄本與人類圍著床期胚胎的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析.轉(zhuǎn)錄譜比較發(fā)現(xiàn)：hTSCs與植入后第8～10d胚胎中的滋養(yǎng)層細(xì)胞相似，表達(dá)LRP2和NR2F2，但不表達(dá)CDX2和EVT、ST的標(biāo)志物；源自hTSCs分化的ST和EVT與胚胎中發(fā)現(xiàn)的ST和EVT具有相似的表達(dá)譜[84].Mischler等人[85]最近也獲得了CDX2+ hTSCs，但是這些細(xì)胞還未與人類CT進(jìn)行比較，尚不明確這些細(xì)胞具體對應(yīng)胚胎滋養(yǎng)層發(fā)育的哪一個階段.成體細(xì)胞來源的滋養(yǎng)層干細(xì)胞系為獲得患者來源的細(xì)胞系提供了可能，也進(jìn)一步擴(kuò)展了滋養(yǎng)層干細(xì)胞系的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的可能.

5 滋養(yǎng)層細(xì)胞系的應(yīng)用

5.1 滋養(yǎng)層細(xì)胞的嵌合體模型

嵌合體實驗是評估干細(xì)胞功能的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法可以在正常發(fā)育組織的背景下測試供體干細(xì)胞譜系發(fā)育的潛能[86].小鼠ESCs的嵌合體實驗表明：小鼠ESCs可以參與小鼠嵌合體胚胎部分譜系的發(fā)育，卻從未參與滋養(yǎng)層譜系的發(fā)育[87].Oda等人[88]將熒光標(biāo)記的小鼠TSCs注射到囊胚后，發(fā)現(xiàn)小鼠TSCs對所有滋養(yǎng)層都有一定的嵌合，但對胚胎組織部分沒有嵌合.Rielland等人[89]的研究結(jié)果也證明即使經(jīng)過多次傳代，小鼠TSCs仍能嵌合到胎盤和頂葉卵黃囊(parietal yolk sac)的滋養(yǎng)層.以上結(jié)果表明小鼠TSCs具有作為干細(xì)胞的發(fā)育潛力.在非人靈長類滋養(yǎng)層干細(xì)胞的嵌合體實驗中，也得到了類似的結(jié)果：Tanaka等人[25]將GFP-macTSCs注射到小鼠8細(xì)胞期的胚胎中并進(jìn)行體外培養(yǎng)至囊胚時期.GFP-macTSCs參與了30%～40%的小鼠嵌合體胚胎體外發(fā)育，所有GFP-macTSC細(xì)胞均嵌合到滋養(yǎng)層部分，并不嵌合到內(nèi)細(xì)胞團(tuán).但人類嵌合體研究涉及到動物福利、供體細(xì)胞來源、宿主物種等倫理問題[90]，不能和小鼠TSCs采用同樣的方式進(jìn)行人類TSCs的嵌合體研究，所以研究者們便從“類器官”方向?qū)θ祟怲SCs的潛能進(jìn)行進(jìn)一步的研究.

5.2 胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞類器官組織模型

近年來，隨著“微型器官”或“類器官”的發(fā)展以及“器官芯片”的建立，3D培養(yǎng)系統(tǒng)取得了迅速的進(jìn)展，3D組織培養(yǎng)比2D組織培養(yǎng)的體內(nèi)生理環(huán)境條件更相似[91].胎盤研究領(lǐng)域也建立了許多胎盤“類器官”的模型.有研究者使用hTSCs建立了可以自我復(fù)制的胎盤類器官模型.Turco等人[92]和Sheridan等人[93]從妊娠早期胎盤組織中純化了細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，建立了一種可以長期培養(yǎng)并遺傳穩(wěn)定的胎盤滋養(yǎng)層類器官組織，該類器官組織能夠分化成ST和EVT，形成絨毛狀結(jié)構(gòu)，具有滋養(yǎng)層細(xì)胞特征的4個標(biāo)準(zhǔn)，能夠檢測到胎盤特異性激素的分泌，并且與正常妊娠早期胎盤的甲基化水平類似.Haider等人[94]也建立了類似的滋養(yǎng)層類器官模型：他們同樣使用妊娠早期(6到7周)的胎盤，獲得了具有增殖能力的滋養(yǎng)層類器官.這些滋養(yǎng)層類器官結(jié)構(gòu)的外層表達(dá)hTSCs的標(biāo)志物，并且會自發(fā)地向結(jié)構(gòu)中心進(jìn)行細(xì)胞融合，從而產(chǎn)生能分泌hCG的ST.全基因組表達(dá)譜顯示，該胎盤滋養(yǎng)層類器官與新分離的CT以及通過2D體外分化產(chǎn)生的ST相似.胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞類器官的三維結(jié)構(gòu)可以部分模擬體內(nèi)細(xì)胞分化和腔隙形成的生理過程[94].它們共同存在的問題是胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞類器官組織模型結(jié)構(gòu)的ST都在內(nèi)部，但在正常發(fā)育的胎盤中,ST在細(xì)胞滋養(yǎng)層的外部.后續(xù)研究可能需要進(jìn)一步優(yōu)化滋養(yǎng)層細(xì)胞自我更新、特化和分化的培養(yǎng)條件.

最近還開發(fā)了幾種細(xì)胞與生物材料3D共培養(yǎng)的方法來研究滋養(yǎng)細(xì)胞功能的模型.Nishiguchi等人[95]首次提出了人類滋養(yǎng)細(xì)胞的血管化胎盤屏障模型，該模型在人類滋養(yǎng)層細(xì)胞(Human pCTB or BeWo cells)上使用了膠原和層粘連蛋白納米膜，以模擬基底膜、支持細(xì)胞及粘附功能.其細(xì)胞之間的通訊連接正常，包括縫隙連接的形成.研究者可以將培養(yǎng)區(qū)域劃分成多個片段，以研究不同細(xì)胞類型之間的相互作用.該模型與妊娠早期人類胎盤的結(jié)構(gòu)及對氧氣的反應(yīng)能力存在相似性，初步證明了滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間存在相互作用.該模型還可以用來闡明細(xì)胞信號跨越屏障的機(jī)制.Kreuder等人[96]則優(yōu)化了上述模型，建立了一種新的無濾膜屏障模型.使用BeWo細(xì)胞系與生物膜內(nèi)的原代胎盤成纖維細(xì)胞和原代人胎盤內(nèi)皮細(xì)胞(代表人胎盤絨毛的三種細(xì)胞成分)共培養(yǎng).在生物膜上共培養(yǎng)兩周后，所有細(xì)胞類型均保持其細(xì)胞類型特異性標(biāo)志物的表達(dá).Nichol等人[97]使用3D生物的打印Gel-MA，還開發(fā)了一種基于細(xì)胞、生長因子和趨化因子，在充滿水凝膠的同心環(huán)中進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的分析方法.該模型具有可以控制其幾何形狀、力學(xué)性能、細(xì)胞活力、形態(tài)以及密度等優(yōu)點.不僅能夠測量滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲程度，而且能夠分析侵襲過程中細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用.Blundell等人[98]則建立了一個多層微流體系統(tǒng)，使人類滋養(yǎng)層細(xì)胞和人類胎兒內(nèi)皮細(xì)胞能夠與生理上相似的空間排列進(jìn)行共培養(yǎng)，以模擬人類胎盤屏障的結(jié)構(gòu)，具有部分人類胎盤的生理特征.以上幾種3D胎盤研究模型都使用絨毛膜癌滋養(yǎng)層細(xì)胞作為類器官模型的材料，但因為絨毛膜癌滋養(yǎng)層細(xì)胞是惡性起源，并不能完全反映滋養(yǎng)層細(xì)胞生理方面情況，所以胎盤類器官模型仍需改進(jìn).

目前研究者們利用不同方法建立了在特定培養(yǎng)條件下生長和分化的胎盤“類器官”模型，這些模型可以用于研究細(xì)胞通訊及其對胎盤功能的影響，顯著促進(jìn)了人們對胎盤結(jié)構(gòu)和功能的理解.因此胎盤“類器官”模型將為人類胎盤疾病的研究提供有力的平臺.

6 總結(jié)與展望

人們對胎盤及胎盤疾病了解甚少，主要原因是缺乏穩(wěn)定的細(xì)胞模型進(jìn)行胎盤相關(guān)疾病的病因和預(yù)防治療研究.靈長類動物滋養(yǎng)層細(xì)胞系的建立為靈長類動物胎盤研究提供了一個很好的平臺，體細(xì)胞來源的滋養(yǎng)層干細(xì)胞系使胎盤疾病、調(diào)控胎盤發(fā)育的相關(guān)機(jī)制研究更為便捷.靈長類動物滋養(yǎng)層干細(xì)胞模型將幫助我們了解人類滋養(yǎng)細(xì)胞缺陷發(fā)育障礙的疾病機(jī)制，例如反復(fù)流產(chǎn)、先兆子癇和子宮內(nèi)生長受限等.除此之外，靈長類動物滋養(yǎng)層干細(xì)胞系還可以為胚胎領(lǐng)域提供幫助，如：類胚體研究是目前胚胎研究的一個熱門方向，同一來源誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞可以為類胚體的研究提供更好的細(xì)胞模型.但目前研究者們只得到了類似于植入后第8～10 d 胚胎中的滋養(yǎng)層細(xì)胞系，還需要優(yōu)化培養(yǎng)方案以得到更早期的細(xì)胞系.總之，該研究領(lǐng)域需要進(jìn)行更多、更深入的研究.